于紅紅 陳茜 李芳 羅瑞熙 王臘 趙立鳳 俞琦 許滔 田維毅

（貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，也是導致心腦血管疾病發(fā)生的重要因素，AS形成及發(fā)展與炎癥反應、血管內皮細胞功能障礙、脂代謝功能紊亂等多種因素密切相關［1］。巨噬細胞通過吸收氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）并沉積于動脈壁導致泡沫化巨噬細胞聚集，形成AS斑塊［2］。已有大量研究證明，中醫(yī)藥治療AS療效確切，近年關于清熱解毒法治療AS的研究也日益增多。四妙勇安湯為古代治療熱毒熾盛之脫疽的著名方劑，出自《驗方新編》，由金銀花、玄參、當歸、甘草四味藥組成?，F(xiàn)代研究證實其具有抗炎、降脂、穩(wěn)定斑塊、抗血栓形成等藥理作用，臨床多用于治療血栓閉塞性脈管炎、AS、高血壓、冠心病等疾病，但其抗AS的分子機制尚不明確［3-5］。本研究以ox-LDL誘導的泡沫化巨噬細胞為AS體外模型，探究四妙勇安湯含藥血清對泡沫細胞活化及自噬的作用，為AS“熱毒蘊結”學說提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±10）g，購自長沙天勤公司，生產許可證號：SCXK（湘）2014-0011；小鼠RAW264.7巨噬細胞購自上海中橋新舟公司。

1.1.2 藥物與主要試劑四妙勇安湯按原方比例配伍（金銀花90 g、玄參90 g、當歸60 g、甘草30 g），購自北京同仁堂貴陽店，常規(guī)制備水煎液；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）；細胞消化液（eBioscience）；青鏈霉素雙抗（南京維森特）；ox-LDL（廣州奕源生物YB-002）；CCK-8試劑盒（日本同仁LF673）；油紅O細胞染色、BCA測定試劑盒（G1262、C0020，北京索萊寶）；IL-6、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒（EK206/3、EK210/4、EK280/3，聯(lián)科）；LC3B、p-mTOR、p-p70S6K抗體（CST3868、5536、9234）、GAPDH抗體（Affinity T0004）、p-AMPK抗體（8813R，北京博奧森）；雷帕霉素（V900930，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備40只SD大鼠適應性喂養(yǎng)5 d，隨機分為正常對照組、四妙勇安湯低、中、高劑量組，每組10只，按“動物與人體等效劑量換算系數”計算大鼠給藥劑量，低、中、高劑量分別為15.75、31.5、63 g/（kg·d）［6］。正常對照組灌胃給予等量生理鹽水，2次/d，連續(xù)1周。股動脈取血，離心，收集上清，滅活補體，過濾除菌后分裝保存。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和干預RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 μl/ml青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（37℃、5%CO2）。實驗中細胞分為正常對照組、低、中、高劑量含藥血清組、模型組、雷帕霉素組。除正常對照組外，其余組均加入終濃度為66 μg/ml的ox-LDL共培養(yǎng)24 d建立泡沫細胞模型。正常對照組及模型組采用20%正常對照組血清干預24 h；低、中、高劑量組分別給予20%濃度的低、中、高劑量含藥血清干預24 h；雷帕霉素組采用mTOR抑制劑雷帕霉素（1 μmol/L）干預24 h。

1.2.3 油紅O染色觀察細胞脂滴棄上清，PBS洗3次，油紅O固定液固定25 min，油紅O染色液浸染15 min，蘇木素染色液復染核1~2 min，水洗后鏡下觀察。

1.2.4 CCK-8檢測泡沫細胞活性用含10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗10 μl/ml的DMEM高糖培養(yǎng)液調整細胞濃度至5×104個/ml，100 μl/孔接種于無菌96孔板，干預細胞后棄培養(yǎng)基，將正常對照組、含藥血清高劑量組分別按10%、20%、30%、40%和50%濃度加入孔中，全部加樣均設6個復孔，孵育24 h后按說明書操作加入試劑，酶標儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.5 ELISA檢測IL-6、IL-10和IFN-γ表達取正常對照組、模型組、不同劑量含藥血清組培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)基上清，按ELISA試劑盒說明書采用酶標儀檢測IL-6、IL-10和IFN-γ表達。

1.2.6 透射電鏡觀察細胞自噬水平變化按1.2.2干預細胞，電鏡固定液4℃固定4 h，PBS洗3次，鋨酸固定液固定2 h，脫水，包埋，切片，染色，透射顯微鏡采集圖像。

1.2.7 免疫熒光標記法檢測LC3Ⅱ表達取對數生長期RAW264.7細胞，調整細胞濃度至5×104個/ml，1 ml/孔接種于含有無菌蓋玻片的24孔板，按1.2.2方法干預細胞。4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，甩干，加入破膜液孵育，洗滌，封閉，棄培養(yǎng)液，加入一抗孵育過夜，洗滌，加入二抗孵育，洗滌，加入DAPI染液避光室溫孵育，洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 RT-PCR檢測AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達收集各組細胞，Trizol法抽提總RNA，逆轉錄為cDNA，PCR儀擴增。AMPK正向引物序列：5'-AACCTGAGAACGTCCTGCTTGATG-3'，反 向：5'-TGACTTCTGGTGCGGCATAATTGG-3'；mTOR正 向引物：5'-CTGATCCTCAACGAGCTAGTTC-3'，反向：5'-GGTCTTTGCAGTACTTGTCATG-3'；p70S6K正 向引物：5'-CTGATTTATGCCTTTCAGACCG-3'，反向：5'-CCTTTTTGATGTAAATGCCCCA-3'；內參GAPDH正向引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。PCR擴增條件為：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5 s，55℃10 s，38個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算基因相對表達。

1.2.9 Western blot檢 測p-AMPK、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達收集細胞，高效細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，調整各組蛋白濃度，沸水浴煮10~15 min使蛋白變性，SDSPAGE電泳，轉至PVDF膜，封閉，依次孵育一抗、二抗，洗膜，加入顯影劑，ChemiDocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯色、曝光，Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，其余采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 油紅O染色鑒定泡沫細胞正常對照組巨噬細胞未見明顯橘紅色脂滴；ox-LDL誘導的泡沫化巨噬細胞明顯可見胞內橘紅色脂滴增多，說明細胞內存在大量脂質，證實泡沫化巨噬細胞模型建立成功（圖1）。

圖1 油紅O染色觀察RAW264.7細胞及泡沫細胞（×200）Fig.1 Oil red O staining of RAW264.7 cells and foam cells（×200）

2.2 四妙勇安湯含藥血清對泡沫化巨噬細胞活性的影響CCK-8結果顯示（表1），與正常對照組相比，含藥血清高劑量組在10%~30%濃度范圍內細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），隨濃度增加，細胞活力呈逐漸下降趨勢（P<0.05）。后續(xù)將采用不影響細胞活力劑量范圍內的20%濃度含藥血清進行實驗。

表1 四妙勇安湯含藥血清對泡沫化巨噬細胞活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

表1 四妙勇安湯含藥血清對泡沫化巨噬細胞活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

Note：Compared with Control，1）P<0.05.

Groups Control High dose Percentage of concentration 10%1.134±0.056 1.027±0.104 20%1.154±0.067 1.045±0.078 30%1.148±0.102 1.021±0.084 40%1.118±0.076 0.841±0.0751）50%1.041±0.064 0.751±0.0591）

2.3 四妙勇安湯含藥血清對泡沫細胞IL-6、IL-10和IFN-γ的影響與正常對照組相比，ox-LDL刺激巨噬細胞24 h后，IL-6、IFN-γ水平顯著升高，IL-10水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，含藥血清各劑量組作用于泡沫化巨噬細胞24 h后，IL-10分泌增加，IL-6、IFN-γ分泌明顯減少（P<0.05，表2）。

表2 各組細胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

表2 各組細胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose IL-6 2 346.37±109.58 3 053.46±86.171）2 643.61±71.432）2 216.49±80.572）2 104.73±101.462）IL-10 140.75±10.26 105.43±11.051）123.97±17.042）151.63±15.062）149.47±14.122）IFN-γ 1 568.36±81.24 2 476.84±102.531）2 017.56±96.542）1 426.82±75.362）1 354.74±63.492）

2.4 透射電鏡觀察細胞自噬水平變化電鏡結果顯示，正常對照組與模型組未見自噬小體；而四妙勇安湯含藥血清各劑量組與雷帕霉素組均可見雙層膜包裹的內含細胞器的自噬小體，同時部分泡沫細胞線粒體結構受損，嵴消失（圖2）。

圖2 透射電鏡觀察細胞超微結構（×1 500）Fig.2 Transmission electron microscope detection of cell ultrastructure（×1 500）

2.5 細胞免疫熒光標記檢測自噬蛋白LC3Ⅱ細胞自噬誘導過程中自噬體形成的特點為LC3Ⅱ轉化率提高，熒光染色下可見斑點狀聚集于自噬體內膜附近。熒光二抗Cy3-山羊抗兔熒光素標記LC3發(fā)出的紅光為陽性表達，藍色為DAPI染色的細胞核。熒光結果顯示，正常對照組和模型組細胞幾乎不可見LC3Ⅱ點狀聚集；經含藥血清各劑量組及雷帕霉素組處理的細胞LC3Ⅱ呈陽性紅光點分布，雷帕霉素組陽性點數量最為顯著（圖3）。

圖3 熒光顯微鏡檢測細胞LC3Ⅱ表達（×200）Fig.3 Fluorescence microscope detection LC3Ⅱexpres?sion（×200）

2.6 四妙勇安湯含藥血清對AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的影響與正常對照組相比，模型組AMPK mRNA表達降低，mTOR和p70S6K mRNA表達提升（P<0.05）。與模型組相比，含藥血清組及雷帕霉素組干預后AMPK mRNA表達顯著升高，而mTOR和p70S6K mRNA表達顯著降低（P<0.05，表3）。

表3 各組細胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

表3 各組細胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups AMPK mTOR p70S6K Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin 1.00±0.00 0.74±0.091）1.19±0.082）1.24±0.102）1.28±0.072）1.34±0.122）1.00±0.00 1.16±0.071）0.74±0.102）0.78±0.072）0.65±0.082）0.60±0.092）1.00±0.00 1.25±0.111）0.84±0.072）0.69±0.062）0.71±0.082）0.64±0.072）

2.7 四妙勇安湯含藥血清對p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達的影響與正常對照組相比，模型組p-AMPK蛋白表達降低，p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達升高（P<0.05）。與模型組相比，含藥血清組及雷帕霉素組干預后p-AMPK蛋白表達顯著升高，而p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達顯著降低（P<0.05，圖4、表4）。

圖4 各組p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達Fig.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group

表4 各組細胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group of cells（±s，n=3）

表4 各組細胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin p-AMPK 1.00±0.00 0.76±0.051）1.52±0.162）1.62±0.182）1.86±0.152）1.91±0.202）p-mTOR 1.00±0.00 1.13±0.051）0.92±0.102）0.86±0.082）0.84±0.072）0.77±0.042）p-p70S6K 1.00±0.00 1.12±0.151）0.91±0.052）0.90±0.082）0.76±0.042）0.61±0.072）

3 討論

AS是多種心腦血管疾病形成的基礎病理因素，其發(fā)病機制涉及內皮細胞損傷、脂代謝失常、平滑肌細胞增殖和分化、巨噬細胞浸潤等多個環(huán)節(jié)［7-8］。自噬對維持細胞內穩(wěn)態(tài)起關鍵作用，是一種細胞穩(wěn)態(tài)的溶酶體依賴性的降解過程，參與機體多種慢性炎癥性疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病過程［9］。自噬在AS發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂等不同階段均發(fā)揮作用，影響AS進程，為AS防治研究提供了新靶點［10］。微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）常用于自噬相關蛋白檢測，脂化后的LC3為LC3Ⅱ，常用于評估自噬活性［11］。AMPK/mTOR/p70S6K是自噬經典通路之一，在自噬調控中起關鍵作用。AMPK、mTOR、p70S6K是AKT/mTOR/p70S6K通 路 關鍵 分子，mTOR可通過抑制自噬途徑誘導巨噬細胞泡沫細胞形成，從而促進AS病理過程，p70S6K是負性自噬調節(jié)通路mTOR的關鍵下游激酶，AMPK激活可抑制mTOR、p70S6K磷酸化，誘導自噬，延緩AS進程［12］。IL-6、IL-10、IFN-γ等炎癥因子激活可介導自噬，而適度自噬又可抑制炎癥因子表達［13］。

本研究采用不同濃度四妙勇安湯含藥血清干預RAW264.7源性泡沫細胞，通過CCK-8法觀察含藥血清對泡沫細胞活化的影響，確定含藥血清干預濃度為20%。目前，體外建立巨噬細胞泡沫化模型最常用的為ox-LDL。研究表明，ox-LDL可誘導內皮細胞自噬且呈劑量依賴性［14］；但也有研究報道，ox-LDL可抑制THP-1源性巨噬細胞自噬，且呈時間和劑量依賴性［15-16］。ox-LDL誘導細胞泡沫化過程中，可抑制亦可誘導細胞自噬，可能與ox-LDL濃度、誘導時間、是否聯(lián)合其他誘導藥物使用以及細胞種類密切相關。本研究采用66 μg/ml ox-LDL誘導RAW264.7細胞，油紅O染色結果顯示，經ox-LDL誘導的細胞內明顯可見大量橘紅色脂滴，說明ox-LDL可誘導巨噬細胞泡沫化。與模型組相比，含藥血清抑制促炎因子IL-6和IFN-γ表達，誘導抑炎因子IL-10表達；與模型組相比，含藥血清組和雷帕霉素組自噬小體數量增加，LC3Ⅱ陽性點數量增多以及調控AMPK/mTOR/p70S6K信號通路，誘導細胞自噬。

綜上所述，四妙勇安湯含藥血清可調節(jié)ox-LDL誘導的泡沫化巨噬細胞活化，降低細胞炎癥因子表達，誘導細胞自噬，可能是其防治AS的作用機制之一。