付艷嬌 王銀雁 劉 巖 肖佳寧 劉國琴 廖斯琪 國立東

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

γ-氨基丁酸（GABA）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有促進(jìn)睡眠、降血壓、改善抑郁等功效，是天然存在的非蛋白質(zhì)類氨基酸，其廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，甚至是某些微生物的代謝產(chǎn)物。發(fā)芽處理已成為植物富集γ-氨基丁酸的一種有效手段[1]。黑豆因種皮黑色而得名，屬于藥食同源類的豆科植物，含有豐富的營養(yǎng)成分，其在萌發(fā)后主要活性物質(zhì)會(huì)明顯增加，包括γ-氨基丁酸[2]。因此，黑豆發(fā)芽也具有富集γ-氨基丁酸的作用。此外，乳酸菌作為益生菌的重要來源，因其安全性高且具有益生作用而備受關(guān)注，包括降膽固醇[3]、降血壓[4]、抗抑郁[5]等。益生菌發(fā)酵產(chǎn)品近年來受到消費(fèi)者普遍青睞，尤其是益生菌發(fā)酵植物基產(chǎn)品逐漸成為熱點(diǎn)。課題組前期從傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中分離篩選出一株性狀優(yōu)良的植物乳桿菌，其可降膽固醇、產(chǎn)γ-氨基丁酸，且對(duì)酸和膽汁表現(xiàn)出了良好耐受性[6]。鑒于以上考慮，本文考察了發(fā)芽對(duì)黑豆中γ-氨基丁酸含量的影響，并以富含γ-氨基丁酸的黑豆芽乳為基質(zhì)，利用植物乳桿菌發(fā)酵制備黑豆芽酸乳，旨在為黑豆芽基益生菌發(fā)酵酸乳產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品為黑豆，產(chǎn)地為黑龍江哈爾濱；植物乳桿菌HUCM115，分離自傳統(tǒng)自然發(fā)酵東北酸菜。

試驗(yàn)儀器設(shè)備包括分析天平、pH計(jì)，由梅特勒-托利多集團(tuán)生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；離心機(jī)，由湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)；紫外可見分光光度計(jì)，由上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱，由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；全自動(dòng)家用豆?jié){機(jī)，由九陽股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌培養(yǎng)與活化。改良MRS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[7]方法配制。植物乳桿菌HUCM115經(jīng)改良MRS液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h，如此傳代2～3代，以恢復(fù)菌種活力。

1.2.2 黑豆發(fā)芽。挑選無破損、大小均一且色澤均勻的黑豆籽粒，清水漂洗后，用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡7 min，再用無菌水漂洗并在室溫下浸泡4 h。隨后于30℃條件下發(fā)芽5 d，每隔12 h無菌水漂洗1次，并記錄每天發(fā)芽情況。

1.2.3 黑豆芽乳制備及GABA含量測定。分別取發(fā)芽 0、1、2、3、4、5 d 的黑豆芽， 調(diào)整豆芽乳干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，用豆?jié){機(jī)進(jìn)行打漿處理，并經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，得黑豆芽乳。參照文獻(xiàn)[8]用70%乙醇提取GABA，同時(shí)用 Berthelot反應(yīng)分別測定發(fā)芽 0、1、2、3、4、5 d 黑豆芽乳中 GABA 含量。以 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/L 濃度的 GABA 標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在645 nm處測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、GABA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.957 5x-0.017 4，R2=0.999 4，具有良好的線性關(guān)系。

1.2.4 黑豆芽酸乳制備。分別取不同發(fā)芽天數(shù)的黑豆芽乳，經(jīng)110℃滅菌10 min，冷卻后得無菌黑豆芽乳。隨后，取已活化的植物乳桿菌HUCM115發(fā)酵液，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，獲得菌泥，再用無菌純凈水重懸，洗滌2次，按1%接種量接種至無菌黑豆芽乳中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察凝乳狀態(tài)及風(fēng)味變化。

1.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳的影響。取發(fā)芽2 d的無菌黑豆芽乳，植物乳桿菌HUCM115按1%接種量進(jìn)行接種，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，以黑豆芽酸乳的活菌數(shù)和pH值為監(jiān)測指標(biāo)，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳的影響?；罹鷶?shù)測定采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽時(shí)間對(duì)黑豆芽感官性狀的影響

隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，黑豆芽的芽長逐漸增加。發(fā)芽處理1 d只有少數(shù)黑豆破皮出芽；發(fā)芽處理2 d時(shí)，黑豆大量出芽，表皮開始脫落；從第4天開始，黑豆芽前端開始逐漸變黃。打漿并過濾得到的黑豆芽乳，隨著發(fā)芽天數(shù)的增加，其豆芽味及豆腥味也隨之增加，從第4天開始出現(xiàn)少量異味。

2.2 發(fā)芽時(shí)間對(duì)黑豆芽乳中GABA含量的影響

按照1.2.3的方法分別測定不同發(fā)芽時(shí)間黑豆芽乳中的GABA含量，結(jié)果如圖2所示。隨著發(fā)芽天數(shù)的增加，黑豆芽乳中的GABA含量明顯升高，直至發(fā)芽第3天時(shí)達(dá)到最高，GABA濃度從初始0.43 g/L增加到第3天0.56 g/L，GABA濃度提高了30.2%，從第4天開始GABA含量出現(xiàn)明顯下降趨勢。

2.3 發(fā)芽時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳的影響

基于黑豆芽乳風(fēng)味和GABA含量的考慮，最終以發(fā)芽0、1、2、3 d的黑豆芽乳為發(fā)酵基質(zhì)，按1.2.4的方法接種植物乳桿菌HUCM115菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從而比較不同發(fā)芽天數(shù)黑豆制作的黑豆芽酸乳在品質(zhì)上的差異。結(jié)果顯示，植物乳桿菌HUCM115按1%接種量接種至不同發(fā)芽天數(shù)的黑豆芽乳中，37℃培養(yǎng)24 h，均能使其凝乳，具有明顯的酸味，并伴有乳清析出。其中，發(fā)芽3 d的黑豆芽酸乳青芽味相對(duì)明顯，故選取無明顯豆芽味和豆腥味的發(fā)芽2 d黑豆芽做進(jìn)一步研究，其GABA濃度較初始濃度可提高20.9%。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳的影響

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳活菌數(shù)的影響?；罹鷶?shù)是益生菌發(fā)酵產(chǎn)品很重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，黑豆芽酸乳中活菌數(shù)的變化情況如圖3所示。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，黑豆芽酸乳中活菌數(shù)逐漸升高，10 h時(shí)活菌數(shù)最高，達(dá)到3.7×109CFU/mL，隨后活菌數(shù)出現(xiàn)下降趨勢。

2.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑豆芽酸乳pH值的影響。pH值大小直接反映了黑豆芽酸乳的酸味程度，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，黑豆芽酸乳pH值變化規(guī)律如圖4所示。黑豆芽酸乳初始pH值為6.4，經(jīng)植物乳桿菌HUCM115發(fā)酵后，pH值逐漸降低，至10 h時(shí)pH值降到最低，為4.2，之后趨于平穩(wěn)。pH值最低點(diǎn)與活菌數(shù)最高點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間一致。

3 結(jié)論與討論

黑豆具有很多重要的生理功能，如抗氧化[9]、抗肥胖[10]、保肝[11]等。研究表明，黑豆在萌芽后多種營養(yǎng)成分含量會(huì)出現(xiàn)不同程度的增加，如VC、葉綠素、異黃酮、蛋白質(zhì)等[12]。本研究對(duì)黑豆發(fā)芽5 d內(nèi)γ-氨基丁酸含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)第3天含量最高而后降低，然而鮑會(huì)梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆γ-氨基丁酸含量在發(fā)芽7 d內(nèi)一直處于上升趨勢，這與文中得到的結(jié)果不完全一致。文中以一株對(duì)酸和膽汁具有一定耐受能力且可降膽固醇的植物乳桿菌HUCM115為發(fā)酵劑菌種，制備了益生菌發(fā)酵黑豆芽酸乳，該產(chǎn)品能否在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的益生作用仍有待于進(jìn)一步證實(shí)。此外，Lee等[13]利用戊糖乳桿菌固態(tài)發(fā)酵發(fā)芽黑豆，發(fā)現(xiàn)總多酚、黃豆苷元、黃豆黃素和染料木黃酮含量明顯提高，并可減輕DNFB誘導(dǎo)的C57BL/6N小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，植物乳桿菌HUCM115發(fā)酵黑豆芽后能否促進(jìn)上述活性物質(zhì)生成，并展現(xiàn)出相應(yīng)的功能性，仍有待于進(jìn)一步深入研究。