吳菁 朱璟 錢靜

結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制尚未明確，導(dǎo)致臨床治療困難，患者預(yù)后欠佳。針對(duì)結(jié)直腸癌的綜合治療以手術(shù)為主，輔以放療、化療、介入治療、靶向治療等[1]。然而，結(jié)直腸癌患者即便積極配合完成標(biāo)準(zhǔn)的治療，仍有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，且以肝轉(zhuǎn)移較為多見[2]。一旦結(jié)直腸癌患者在術(shù)后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，將會(huì)增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[3]。大量研究證實(shí)結(jié)直腸癌患者術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移是受分子多層級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的，內(nèi)源性非編碼微小分子RNA（microRNA，miRNA）作為分子研究中熱點(diǎn)類型，其中miRNA-203 是關(guān)注度較高的一種[4]。miRNA-203 表達(dá)量是否與結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，目前相關(guān)報(bào)道甚少。本研究分析247 例結(jié)直腸癌患者臨床資料及其外周血miRNA-203 表達(dá)量，探索結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，為結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年1月至2015年12月在蘇州市第九人民醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者247 例作為觀察對(duì)象。其中男性145 例，女性102 例；年齡26～79 歲，＜60 歲86 例，≥60 歲161 例。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì) 通過對(duì)患者術(shù)后隨訪觀察，統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況，收集其臨床資料，找出直腸癌患者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，并根據(jù)各危險(xiǎn)因素指標(biāo)構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，對(duì)模型進(jìn)行臨床驗(yàn)證。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理審查批準(zhǔn)（編號(hào)：SZ-ZD90721）。

1.2.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 收集患者的電子病歷獲取信息，包括年齡、性別、腫瘤最大直徑、臨床分期、分化程度、術(shù)前有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前腫瘤標(biāo)記物、術(shù)前生化指標(biāo)等。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）臨床資料完整；2）符合《NCCN 結(jié)直腸癌診治指南(2017.v1)》中的原發(fā)性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；2）臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期；3）均在腹腔鏡下行腫瘤根治切除術(shù)；4）術(shù)后復(fù)查均在本院進(jìn)行；5）有外周血miRNA-203 表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果；6）均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）除直腸癌外，合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；2）肝、腎功能異常；3）合并心、腦、血液系統(tǒng)等影響患者治療和預(yù)后的疾病；4）根治手術(shù)前就已確診肝轉(zhuǎn)移。

1.2.3 miRNA-203 檢測(cè)方法 1）樣本采集：于術(shù)前采集患者的空腹肘靜脈血5mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管內(nèi)，室溫靜置10 min，離心處理（轉(zhuǎn)速為1500 r/min，離心時(shí)間為10 min，離心半徑r=15 cm），提取血清，-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?）miRNA 提取：采用TRIzol 試劑提取血清中的總RNA，取1μL，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的純度；3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用賽默飛世爾科技（中國）有限公司的TaqMan miRNA 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物：正向5’-TGT CCATGAGAGCTCAGCA-3’，反 向5’-TCGTACAGC ATGTCGAATGCC-3’；完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參為U6，40 個(gè)循環(huán)（95℃60 s、60℃60 s、72℃60 s）延伸72℃（7 min），根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算miRNA-203 的表達(dá)量。

1.2.4 隨訪與分組 隨訪截止時(shí)間為2017年12月，隨訪方式以門診復(fù)查的方式進(jìn)行，患者出院后每3 個(gè)月復(fù)查1 次。隨訪內(nèi)容：采用纖維腸鏡、腹部B 超、胸部CT 等評(píng)估患者病情狀況，并參照《結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷和綜合治療指南（2016 版）》[6]中的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)準(zhǔn)，將隨訪期間出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移納入轉(zhuǎn)移組，其他納入非轉(zhuǎn)移組。

1.2.5 臨床驗(yàn)證 選擇2018年1月至2019年2月在本院行根治性手術(shù)切除的102 例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行跟蹤隨訪，隨訪截至2020年12月，以驗(yàn)證模型在臨床應(yīng)用的實(shí)際效能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析；多因素Logistic 回歸分析找出結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素并建立相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型，應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC）檢測(cè)其區(qū)分度，應(yīng)用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)評(píng)價(jià)其校準(zhǔn)度，驗(yàn)證模型的正確率。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的單因素分析

在247 例結(jié)直腸癌患者的術(shù)后隨訪中出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移有81 例（轉(zhuǎn)移組），占32.79%，其余未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（非轉(zhuǎn)移組）。轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、D-二聚體、白蛋白（serum albumin，Alb）、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）、miRNA-203 表達(dá)量指標(biāo)的比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（義（表1）。

2.2 結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的Logistic 回歸分析

將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，以患者術(shù)后是否出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）作為因變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果提示分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA、D-二聚體、Alb、sICAM-1、miRNA-203 表達(dá)量均是結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表2。

表2 結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的多因素Logistic 回歸分析

2.3 結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

根據(jù)表2 回歸系數(shù)與常數(shù)項(xiàng)構(gòu)建模型，得出預(yù)測(cè)模型方程為：Logit（P）=1.203×分化程度（0 表示高分化，1 表示中分化，2 表示低分化）+2.065×淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（0表示無，1 表示有）+1.257×CEA（錄入實(shí)際值）+0.829×D-二聚體（錄入實(shí)際值）+0.395×Alb（錄入實(shí)際值）+1.156×sICAM-1（錄入實(shí)際值）+1.484×miRNA-203 表達(dá)量（錄入實(shí)際值）-34.187。以預(yù)測(cè)概率值為檢驗(yàn)變量，以是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移為狀態(tài)變量，作ROC 曲線評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的區(qū)分度，結(jié)果提示ROC 曲線下面積為0.895（95%CI：0.830 ～0.959），通過最大約登指數(shù)（0.722）得出該模型的閾值為0.482，對(duì)應(yīng)的靈敏度為0.896，特異度為0.904（圖1）。采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)評(píng)價(jià)該預(yù)測(cè)模型的校準(zhǔn)度，得出χ2=3.014，P=0.421，提示模型擬合良好（圖2）。

2.4 預(yù)測(cè)模型的臨床驗(yàn)證

采用模型對(duì)102 例結(jié)直腸癌患者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出模型預(yù)測(cè)的靈敏度為86.21%（25/29），特異度為89.04%（65/73），準(zhǔn)確率為88.24%（90/102），見表3。

表3 模型的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率 例

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率在中國的惡性腫瘤中位居第三位，死亡率位居第五位，且在近年來有明顯上升趨勢(shì)[7]。大量研究表明結(jié)直腸癌術(shù)后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡升高的主要因素，占60%～70%[8-9]。有效鑒別高風(fēng)險(xiǎn)患者，對(duì)改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后至關(guān)重要。

本研究對(duì)247 例結(jié)直腸癌患者術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)32.79%患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移可能是受諸多因素相互作用。其中腫瘤分化程度、是否存在淋巴結(jié)受累與結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)。癌細(xì)胞與正常細(xì)胞差異越大，說明分化程度越低，癌細(xì)胞分裂繁殖生長越活躍，惡性程度越高，易向直結(jié)腸周圍組織、毛細(xì)血管、淋巴管侵襲和轉(zhuǎn)移。而癌細(xì)胞侵襲淋巴結(jié)，造成淋巴結(jié)受累，則說明癌細(xì)胞倍增時(shí)間短，增殖速度較快，且播散范圍廣。癌細(xì)胞可沿結(jié)直腸壁組織上的淋巴管網(wǎng)，經(jīng)毛細(xì)血管順行或逆行不斷擴(kuò)散，導(dǎo)致手術(shù)無法完整地切除癌灶，進(jìn)而增加術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。本研究也發(fā)現(xiàn)分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，再次佐證了上述結(jié)論。關(guān)于血液指標(biāo)，腫瘤標(biāo)記物（如CEA、CA19-9 等）是臨床診斷惡性腫瘤常用手段，CEA 異常升高可促進(jìn)黏附分子表達(dá)和惡性腫瘤細(xì)胞的存活[10]。有研究證實(shí)CEA 高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[11-12]。但CEA水平在其他惡性腫瘤（如胃癌、乳腺癌等）也會(huì)異常升高[13-14]，預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后的靈敏度并不高。而CA19-9 的識(shí)別譜相對(duì)較窄，單獨(dú)預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的特異度不強(qiáng)。早在1865年，Trousseau 就發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者的凝血功能異常，導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移加快、靜脈血栓形成，威脅患者生命[15]。D-二聚體是反映凝血/纖溶系統(tǒng)的常用指標(biāo)[16-17]，其表達(dá)異常升高，標(biāo)志著患者機(jī)體的纖溶和凝血系統(tǒng)均被激活，處于高凝狀態(tài)。D-二聚體水平與腫瘤的良惡性及惡性程度呈正相關(guān)[18]，高表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素[19-20]。結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程還與代謝功能紊亂有關(guān)[21-22]，隨著病情發(fā)展，結(jié)直腸組織周圍的微血管通透性會(huì)增加，導(dǎo)致Alb 滲透率增加，Alb 含量降低，蛋白質(zhì)的分解代謝升高，而合成代謝下降，致使負(fù)氮平衡，影響患者預(yù)后。sICAM-1 是免疫球蛋白超家族的黏附分子，其表達(dá)升高會(huì)激活癌細(xì)胞核DNA 的轉(zhuǎn)錄活性，提高癌細(xì)胞的黏附能力[23]，促進(jìn)癌細(xì)胞異常增殖與分化，增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

高度保守型的內(nèi)源性miRNA 廣泛涉及人類生命的重要過程，如細(xì)胞增殖、代謝、遷移、分化等。正常表達(dá)的miRNA能夠調(diào)控細(xì)胞分化、增殖，但異常表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。miRNA-203 作為微小分子中的一員，有研究表明miRNA-203 具有抑制癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的miRNA-203 表達(dá)量低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，且miRNA-203 是影響結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。miRNA-203 參與調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，低表達(dá)miRNA-203 在腫瘤細(xì)胞中可促進(jìn)VEGF 分泌[25]，從而影響腫瘤血管系統(tǒng)形成及實(shí)體腫瘤生長過程。

結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移是由原癌細(xì)胞脫離并以各種轉(zhuǎn)移途徑到達(dá)肝臟組織中繼續(xù)增殖。本研究根據(jù)上述危險(xiǎn)因素變量的回歸系數(shù)與常數(shù)項(xiàng)建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)該模型有較高的靈敏度和特異度。究其原因，可能是本研究應(yīng)用獨(dú)立樣本驗(yàn)證，排除不相關(guān)或相關(guān)不大的特征，降低其對(duì)模型的影響。將顯著相關(guān)的多指標(biāo)聯(lián)合，能確切地實(shí)現(xiàn)信息互補(bǔ)，增強(qiáng)診斷的靈敏度和特異度。經(jīng)驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)的總體正確率為88.24%，說明通過結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的各種危險(xiǎn)因素構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，能提高預(yù)測(cè)效能，為臨床發(fā)現(xiàn)高?；颊咛峁┲笇?dǎo)。

綜上所述，分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA 高表達(dá)、D-二聚體高表達(dá)、Alb 降低、sICAM-1 升高、低表達(dá)miRNA-203 均是結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。根據(jù)危險(xiǎn)因素構(gòu)建模型，能夠有效評(píng)估結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。但本研究的病例屬于單中心研究，結(jié)果難免存在偏倚，將在今后進(jìn)行多中心研究，增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性。