麥文頂，黃志敏，唐 宇，江旖旎，邱少彬，邱 菲，陸良喜，吳金玉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仁愛(ài)分院，廣西 南寧 530023)

慢性腎衰竭(chronic renal falure，CRF)是一種常見(jiàn)的腎臟疾病，其特征是腎功能逐漸下降。CRF是各種慢性腎臟病持續(xù)發(fā)展的結(jié)局，患者的腎臟功能受到不可逆性的損傷，并引起多系統(tǒng)受累，嚴(yán)重威脅患者生命。胃腸道癥狀是慢性腎臟病患者常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，在病程的初期即可發(fā)生[1]，且眾多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRF會(huì)造成腸道菌群紊亂這一觀點(diǎn)[2-4]。Meijers等[5]在2011年首次提出腸腎軸理論，指明了腸道功能在腎臟疾病的發(fā)展中起到重要作用，為腎臟疾病的治療提供了新思路?，F(xiàn)代研究表明，腸道可分泌尿毒素，并影響其代謝[6]。在腎臟疾病發(fā)展過(guò)程中，腎臟功能減弱，代謝毒素功能障礙，毒素在腸道蓄積，腸道原有的菌群結(jié)構(gòu)被打破，有害微生物大量繁殖而有益菌群被抑制，各類(lèi)毒素大量產(chǎn)生，甚至通過(guò)腸道屏障進(jìn)入血液，流向全身各系統(tǒng)，增加CRF患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾腎虧虛、濁毒瘀阻”為CRF基本病機(jī)，“瘀”貫穿于CRF始終[7]，CRF引起的腎“瘀”是引起脾胃、腸道功能失調(diào)的根本，腸腎軸理論與其不謀而合。前期研究發(fā)現(xiàn)，三七注射液有減輕微炎癥狀態(tài)、改善腎功能、延緩腎纖維化進(jìn)程的作用[8-10]，但其基于腸腎軸理論的作用機(jī)制和靶點(diǎn)尚未明確。本研究主要探討三七注射液對(duì)CRF大鼠腸道菌群多樣性結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步明確三七注射液基于腸腎軸理論在治療CRF過(guò)程中的作用靶點(diǎn)和機(jī)制，為三七治療CRF提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD(Sprasue-Dawley)雄性大鼠120只，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤公司，鼠齡10～12周，體重(200±36)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)：00098611。大鼠在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為18～25 ℃、濕度為50%～60%，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)大鼠維持型顆粒飼料喂養(yǎng)，正常飲水、攝食，燈光按自然日常照明、12 h明暗交替，定時(shí)清洗籠舍，打掃動(dòng)物房。

1.2藥物 三七注射液，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，100 mL/瓶，含生藥20 g，桂衛(wèi)藥制號(hào)(1998)005121；鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000292。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、三七低劑量組、三七中劑量組、三七高劑量組、貝那普利組，每組20只。正常組無(wú)處理，其余5組大鼠均采用國(guó)際通用的5/6腎臟切除法建立CRF模型[11]。 造模成功后，正常組與模型組大鼠給予生理鹽水10 mL/(kg·d)腹腔注射，三七低、中、高劑量組大鼠分別給予三七注射液1 g生藥/(kg·d)、2 g生藥/(kg·d)、3 g生藥/(kg·d)腹腔注射，貝那普利組給予鹽酸貝那普利5 mg/(kg·d)灌胃，均1次/d，共8周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1腎功能指標(biāo) 干預(yù)8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，對(duì)各組大鼠腹主動(dòng)脈采血約4 mL，采用生化法檢測(cè)尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。

1.4.2糞便生物多樣性分析 干預(yù)8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，在滅菌超凈臺(tái)上操作，收集大鼠糞便：預(yù)先使用紫外線(xiàn)對(duì)操作所需材料和操作室進(jìn)行滅菌，隨后將濾紙放入籠具，每籠放入大鼠1只。在大鼠肛門(mén)和下腹部，用鑷子進(jìn)行輕度刺激，促進(jìn)大鼠排便，排便后立刻收集糞便，放入凍存管中并做好標(biāo)記放入液氮中，0.5 h后移入-80 ℃冰箱保存。共收集到33個(gè)糞便標(biāo)本，其中正常組、模型組、貝那普利組各5個(gè)，三七低、中、高劑量組各6個(gè)。將糞便標(biāo)本提取樣品總DNA后，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，采用雙末端測(cè)序(Paired-End)法獲得測(cè)序序列，進(jìn)行拼接質(zhì)控、優(yōu)化數(shù)據(jù)，OTU聚類(lèi)分析，在門(mén)、屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成；使用α多樣性分析、β多樣性分析等分析方法，在多層面上對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析，挖掘樣品之間的差異(委托北京百邁客生物科技有限公司完成)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清BUN、SCr水平比較 正常組與各藥物干預(yù)組BUN、SCr水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且三七高劑量組均明顯低于三七低劑量組、三七中劑量組和貝那普利組(P均<0.05)，三七中劑量組和貝那普利組均明顯低于三七低劑量組(P均<0.05)，貝那普利組均明顯低于三七中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組及慢性腎衰竭各組大鼠血清BUN、SCr水平比較

2.2各組大鼠腸道菌群多樣性分析 α多樣性分析顯示，模型組Shannon、ACE、Chao指數(shù)均明顯低于正常組(P均<0.05)；三七低、中劑量組ACE、Chao指數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，且三七中劑量組ACE、Chao指數(shù)均明顯高于三七低劑量組(P均<0.05)；三七高劑量組與貝那普利組Shannon、ACE、Chao指數(shù)均明顯高于模型組、三七低劑量組、三七中劑量組(P均<0.05)，但三七高劑量組Shannon、ACE、Chao指數(shù)均明顯低于貝那普利組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。根據(jù)樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的OTU數(shù)和Shannon指數(shù)，分別繪制稀釋性曲線(xiàn)和香農(nóng)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1及圖2)，可見(jiàn)樣本在15000 Reads左右時(shí)曲線(xiàn)逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，代表測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠。

表2 正常組及慢性腎衰竭各組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)比較

2.3各組大鼠腸道菌群相似度比較分析 使用QIIME軟件進(jìn)行β多樣性分析，通過(guò)主坐標(biāo)分析法(PCoA)來(lái)評(píng)估菌群的β多樣性，并據(jù)此繪制PCoA分析圖，顯示正常組與三七低劑量組、三七中劑量組、貝那普利組樣本間距離較為接近(相似性高)，三七高劑量組與其余各組樣本間距離差距較大。見(jiàn)圖3。

2.4各組大鼠腸道菌群物種組成分析 將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，進(jìn)而在門(mén)、屬水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。

測(cè)序序列數(shù)C代表正常組；L代表三七低劑量組；M代表三七中劑量組；H代表三七高劑量組；Mo代表模型組；P代表貝那普利組；數(shù)字為組內(nèi)樣本編號(hào)

測(cè)序序列數(shù)C代表正常組；L代表三七低劑量組；M代表三七中劑量組；H代表三七高劑量組；Mo代表模型組；P代表貝那普利組；數(shù)字為組內(nèi)樣本編號(hào)

橫、縱坐標(biāo)分別為兩個(gè)特征值，百分?jǐn)?shù)代表其對(duì)樣品間差異的影響程度

2.4.1門(mén)水平組成分析 樣本細(xì)菌在門(mén)水平的分布以及各組樣本平均豐度組成中，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)豐度百分比最高，平均超過(guò)75%，見(jiàn)圖4。貝那普利組擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)相對(duì)豐度百分比次之，其余各組樣本中變形菌門(mén)(Proteobacteria)相對(duì)豐度百分比次之，其他菌門(mén)相對(duì)豐度百分比均不到1%，見(jiàn)圖5。

C代表正常組；L代表三七低劑量組；M代表三七中劑量組；H代表三七高劑量組；Mo代表模型組；P代表貝那普利組；數(shù)字為組內(nèi)樣本編號(hào)

圖5 正常組及慢性腎衰竭各組大鼠糞便樣本菌群門(mén)水平組成情況

2.4.2屬水平組成分析 各樣本在屬水平上共檢測(cè)到51種豐度大于0.1%的細(xì)菌，細(xì)菌組成和豐度之間的差異隨著細(xì)菌分類(lèi)的細(xì)化而越發(fā)明顯，見(jiàn)圖6。相對(duì)于模型組和三七低劑量組，貝那普利組、三七高劑量組和三七中劑量組中大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)豐度下降顯著，乳桿菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、未培養(yǎng)的細(xì)菌(uncultured_bacterium_f_ Muribaculaceae)、瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_UCG-014)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus_1)等豐度顯著上升，且以三七高劑量組最為顯著，見(jiàn)圖7。

圖7 正常組及慢性腎衰竭各組大鼠糞便樣本菌群屬水平組成情況

3 討 論

CRF的進(jìn)展伴隨各種并發(fā)癥，其中厭食、惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等胃腸道癥狀最常見(jiàn)，主要是由腎臟疾病惡性發(fā)展使毒素堆積及排泄障礙所致[12]。腸腎軸理論提出后，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)CRF與腸道之間存在明顯關(guān)系，并且這種影響是雙向的、多方面的[13-15]：①CRF患者腎臟排泄功能減弱，大量毒素堆積造成腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂，首先是益生菌減少，其次腐生菌過(guò)度生長(zhǎng)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變使體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡被打破；②體內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，破壞黏膜屏障，增加腸道黏膜屏障的通透性，進(jìn)而損害腸道屏障功能；③腸道內(nèi)有害代謝產(chǎn)物生成增多，毒素排泄障礙而不斷蓄積，腸源性毒素、條件致病菌及致病菌移位進(jìn)入血液循環(huán)，又加劇了組織損害，同時(shí)也加快了CRF的發(fā)展。

C代表正常組；L代表三七低劑量組；M代表三七中劑量組；H代表三七高劑量組；Mo代表模型組；P代表貝那普利組；數(shù)字為組內(nèi)樣本編號(hào)

腸道具有消化、排泄等功能，寄生有大約1 100種微生物，其總數(shù)約為1 014個(gè)，在其組成結(jié)構(gòu)中細(xì)菌占主要部分，因其相互間會(huì)產(chǎn)生各種反應(yīng)，如免疫應(yīng)答等，因此腸道被認(rèn)為是人體最大的免疫器官[16]。根據(jù)腸道菌群與宿主的關(guān)系，可將其大致分為3種：①有益菌群，如雙歧桿菌等具有營(yíng)養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用；②條件致病菌群，如腸球菌等，在健康機(jī)體的腸道中無(wú)害，特定條件下具備侵襲性，危害宿主身體健康；③寄生的病原菌群，如致病性大腸桿菌、彎曲桿菌及部分真菌等，在健康機(jī)體腸道生態(tài)平衡時(shí)數(shù)量較少，其數(shù)量增加會(huì)消耗能量產(chǎn)生對(duì)宿主有害的代謝產(chǎn)物[13]。謝珊[2]報(bào)道，人體腸道菌群主要由7門(mén)組成，其中擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在腸道菌群中約占90%，而CRF患者普遍具有腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)的現(xiàn)象，并提出這種失調(diào)的特征是低豐度類(lèi)群最先受到影響，并且對(duì)腸道健康有益的菌群數(shù)量顯著減少。本研究顯示，CRF大鼠血清BUN和SCr水平明顯升高，三七注射液干預(yù)各組血清BUN和SCr水平且呈劑量依賴(lài)性降低。提示三七注射液具有改善腎功能作用，以中、高劑量作用顯著。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)6組33個(gè)糞便樣本進(jìn)行了測(cè)序分析，根據(jù)稀釋性曲線(xiàn)和香農(nóng)曲線(xiàn)分析證明測(cè)序數(shù)量及樣本數(shù)足夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。33個(gè)糞便樣本共獲得有效序列1 111 126條，序列有效長(zhǎng)度350～500 bp，雙端序列拼接、過(guò)濾后共產(chǎn)生1 017 408條Clean tags，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生11 164條Clean tags，平均產(chǎn)生30 831條Clean tags。將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類(lèi)，劃分OTU，在97%的相似水平下獲得2 477類(lèi)OTU，基于OTU分析結(jié)果，通過(guò)α多樣性分析研究樣品內(nèi)部的物種多樣性，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算各樣品在97%相似度水平下的Shannon、ACE及Chao共3個(gè)指數(shù)。Shannon指數(shù)的大小取決于樣品群落中的物種豐度和物種均勻度，是衡量物種多樣性的指標(biāo)。當(dāng)樣品的物種豐度相同，群落中各物種均勻度越大，則群落多樣性越大。Shannon指數(shù)的大小反映了樣品物種多樣性的高低；ACE和Chao指數(shù)則主要受菌落豐度水平影響，用于衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。腸道菌群相似度是反映腸道功能和生理狀態(tài)的典型表現(xiàn)之一，證候、環(huán)境以及體型的不同都會(huì)導(dǎo)致腸道菌群相似性出現(xiàn)差異[17-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠Shannon、ACE、Chao指數(shù)明顯低于正常組，各藥物干預(yù)組均明顯高于模型組，提示三七注射液和貝那普利均可改善CRF大鼠腸道菌群多樣性。近年來(lái)研究顯示，CRF患者存在致病菌增多、益生菌減少的情況[20]。溫珍亮[21]研究報(bào)道，大腸桿菌-志賀菌屬僅在腸道損傷時(shí)出現(xiàn)并大量增加,在穩(wěn)態(tài)及腸道損傷好轉(zhuǎn)時(shí)不能被檢出。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七注射液干預(yù)后在屬水平上CRF大鼠的腸道細(xì)菌分布比例有較大改變，中、高劑量組中乳桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃菌屬、瘤胃球菌屬豐度顯著上升，大腸桿菌-志賀菌屬豐度明顯下降，提示中、高劑量的三七注射液更有助于改善菌群結(jié)構(gòu)。

綜上所述，CRF大鼠體內(nèi)腸道菌群多樣性減少，菌群結(jié)構(gòu)被破壞，代謝毒素增多，符合腸腎軸理論內(nèi)涵；三七注射液干預(yù)可改善腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)腎臟功能，減少代謝毒素產(chǎn)生，以中、高劑量作用明顯。提示三七注射液延緩CRF大鼠病程進(jìn)展的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。