馬 陽(yáng)，鄭衛(wèi)紅，張 培，張建發(fā)，郭立華，陳立宏，彭正萍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.邢臺(tái)市隆堯縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺(tái) 055350； 3.河北省耕地質(zhì)量監(jiān)測(cè)保護(hù)中心，河北 石家莊 050051；4.邢臺(tái)市土壤肥料站，河北 邢臺(tái) 054000）

甜瓜（Cucumis meloL.）是我國(guó)重要的高效園藝作物，近年來(lái)，甜瓜生產(chǎn)規(guī)?；?、設(shè)施化、專業(yè)化程度提高，連作種植導(dǎo)致甜瓜連作障礙日趨惡化，嚴(yán)重影響甜瓜產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［1-2］。明確甜瓜連作障礙，是保障甜瓜產(chǎn)業(yè)高產(chǎn)高效的關(guān)鍵。土壤養(yǎng)分失調(diào)、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、土壤酶活性降低等是造成甜瓜連作障礙發(fā)生的原因［3-5］。周華蘭等研究表明，馬鈴薯長(zhǎng)期連作，其土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)破壞，土壤板結(jié)，透氣性差，物理性狀惡化，土壤脲酶、堿性磷酸酶活性也隨種植年限的增加而降低［6］。連作還會(huì)導(dǎo)致土壤中速效氮富集，而有效磷和速效鉀含量降低，營(yíng)養(yǎng)成分嚴(yán)重失調(diào)，土壤酸化并伴隨鹽漬化［7］。土壤微生物多樣性的改變與土壤理化性質(zhì)、酶活性以及植物根系分泌物和養(yǎng)分的富集均有一定的相關(guān)性［8-9］。相關(guān)研究表明，隨著作物種植年限的增加，土壤微生物選擇性富集，土壤微生物總量、細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，真菌數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［10］。

針對(duì)土壤退化性狀進(jìn)行土壤修復(fù)以期為設(shè)施甜瓜生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)，同時(shí)更好的指導(dǎo)生產(chǎn)。楊永和柳玲玲等［11-12］研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥施用改善土壤理化性狀，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)微生物活動(dòng)和有益菌的繁殖，在分解過(guò)程中增加土壤細(xì)菌和放線菌含量，抑制病原菌的繁殖，降低連作障礙發(fā)生，是恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡和抑制土傳病害的有效改良劑。根據(jù)土壤類型及作物各時(shí)期需肥特性，合理選擇土壤調(diào)理劑，改善作物根際土壤pH，有效降低枯萎病等土傳病害發(fā)病率，是促進(jìn)植株生長(zhǎng)，緩解連作障礙的有效途徑［1］。高雪蓮等［13］研究表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)能降低土壤真菌和病原菌的數(shù)量，增加細(xì)菌和放線菌數(shù)量，改善土壤微生物區(qū)系，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，降低發(fā)病率，提高甜瓜產(chǎn)量。因此，合理施用化肥，增施有機(jī)肥、微生物菌肥和土壤調(diào)理劑不僅活化土壤營(yíng)養(yǎng)元素，而且調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)良好土壤結(jié)構(gòu)形成。

本文針對(duì)連續(xù)種植、肥藥過(guò)量施用造成的土壤性質(zhì)惡化、微生態(tài)失衡等問(wèn)題，以設(shè)施甜瓜為研究對(duì)象，研究不同調(diào)控措施對(duì)土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌多樣性及甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為河北省設(shè)施甜瓜連作障礙的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)于2020 年2 月24 日至6 月6 日在河北省邢臺(tái)市隆堯縣小孟村（E 114°50′，N 37°31′）設(shè)施大棚進(jìn)行。供試作物為厚皮甜瓜西洲25，供試肥料為底肥復(fù)合肥（純N-P2O5-K2O 為15-15-15）， 佐 田 氏 有 機(jī) 肥（ 有 機(jī) 質(zhì)≥45%，N+P2O5+K2O ≥5%）、微生物菌劑（主要菌種為枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)≥2 億/g）、土壤調(diào)理 劑（K2O ≥4%，MgO ≥4%，CaO ≥25%，SiO2≥20%）、水溶復(fù)合肥（純N-P2O5-K2O 為15-5-36）。供試土壤為壤質(zhì)潮褐土，基本理化性狀為：土壤深度0 ～20 cm，pH 8.08，有機(jī)質(zhì) 15.88 g/kg，全氮含量1.17g/kg，有效磷19.56 mg/kg， 速效鉀149.58 mg/kg，水溶性鹽總量1.37 g/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 個(gè)施肥處理：T1 復(fù)合肥+有機(jī)肥；T2 復(fù)合肥+有機(jī)肥+微生物菌劑；T3 復(fù)合肥+有機(jī)肥+土壤調(diào)理劑；T4 復(fù)合肥+有機(jī)肥+微生物菌劑+土壤調(diào)理劑。試驗(yàn)選擇種植年限為5 年的棚室，每個(gè)處理設(shè)3 組重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。以甜瓜‘西洲25’為供試作物，根據(jù)各處理施肥調(diào)控要求進(jìn)行提前混勻，于2 月24 日施肥后進(jìn)行旋耕（具體處理及施肥量見(jiàn)表2），于2 月26 日進(jìn)行定植，密度為2.4萬(wàn)株/hm2，澆定植水。

后面分別在開(kāi)花期、坐瓜初期、膨瓜期追施水溶復(fù)合肥375、375、750 kg/hm2，其他田間病蟲(chóng)草害和栽培管理等技術(shù)措施按照當(dāng)?shù)貙?shí)際生產(chǎn)水平統(tǒng)一管理。于成熟期進(jìn)行測(cè)產(chǎn)、采集耕層土壤，每個(gè)小區(qū)采集3 組混合放到無(wú)菌袋中，將采集的土樣低溫保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后分成3 份。其中1 份土樣自然風(fēng)干，過(guò)0.2 mm 網(wǎng)篩，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)的測(cè)定；1 份4 ℃冷藏保存，開(kāi)展可培養(yǎng)微生物的測(cè)定；1 份放入-80 ℃冰箱保存，用于微生物細(xì)菌多樣性 的測(cè)定。

表1 試驗(yàn)處理及調(diào)控措施的底肥施用量Table 1 The amount of base fertilizer used in the experimental treatment and control measures kg/hm2

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤pH 采用電位法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用油浴加熱重鉻酸鉀氧化-容量法測(cè)定；全氮采用凱氏定氮法測(cè)定；有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度計(jì)法測(cè)定；水溶性鹽總量采用電導(dǎo)法測(cè)定［14］。

1.3.2 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測(cè)定 土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量測(cè)定參考《土壤微生物研究原理與方法》［15］。采用稀釋涂布平板法進(jìn)行測(cè)定，細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用改良高氏1 號(hào)培養(yǎng)基。

1.3.3 土壤微生物多樣性分析 委托北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性分析，基 于Illumina miseq 測(cè) 序 平 臺(tái)， 采 用 雙 末 端 測(cè)序 法（Paired-end）對(duì) 細(xì) 菌 的16S rDNA 基 因 的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads拼接過(guò)濾，在97%的相似水平下將序列分成不同的操作分類單元OTU（Operational taxonomic units），并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示各處理樣品的物種構(gòu)成；進(jìn)一步進(jìn)行α(Alpha)多樣性分析、β(Beta)多樣性分析和顯著物種差異分析等。

1.3.4 甜瓜產(chǎn)量及可溶性糖測(cè)定 果實(shí)成熟后，根據(jù)小區(qū)面積計(jì)算產(chǎn)量，每個(gè)小區(qū)選取具有代表性果實(shí)3 個(gè)，采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖［16］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通 過(guò)Excel 2016 和IBM SPSS 21.0 統(tǒng) 計(jì) 分 析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異顯著性檢驗(yàn)使用鄧肯法（Duncan）（P＜0.05）。采用Mothur（version v.1.30）軟件進(jìn)行Alpha 多樣性分析，QIIME 軟件進(jìn)行Beta 多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同調(diào)控措施對(duì)甜瓜產(chǎn)量和可溶性糖的影響

由表2 可知，不同調(diào)控措施下的甜瓜果實(shí)產(chǎn)量呈現(xiàn)T4 ＞T3 ＞T2 ＞T1，其中T4 較其他各處理顯著增產(chǎn)32.65% ～40.29%，而T1、T2、T3 處理間產(chǎn)量無(wú)顯著差異。與T1 比，T2、T3 和T4 處理的甜瓜可溶性糖含量分別顯著提高29.36%、22.48%和31.19%，與T3 比，T2 和T4 處理的甜瓜可溶性糖含量分別顯著增加5.62%和7.12%，T2 和T4 間差異不顯著。表明土壤增施有機(jī)肥、配施生物菌劑和土壤調(diào)理劑可有效增加甜瓜產(chǎn)量，促進(jìn)果實(shí)可溶性糖的積累，其中增施生物菌劑對(duì)可溶性糖含量的積累效果顯著。

表2 不同調(diào)控措施下的甜瓜產(chǎn)量和可溶性糖含量Table 2 Muskmelon yield and soluble sugar content under different control measures

2.2 不同調(diào)控措施對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表3 可知，不同調(diào)控措施間的土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷、速效鉀無(wú)顯著性差異；水溶性鹽總量T2 ＞T1 ＞T3 ＞T4，其中T4 較T1、T2 和T3 分別降低24.86%、31.73% 和23.19%，而T1、T2 和T3 間無(wú)顯著差異。與試驗(yàn)前基礎(chǔ)養(yǎng)分比，試驗(yàn)后土壤全氮和有效磷平均分別提高18.80%和45.77%，土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效鉀和水溶性鹽總量分別降低2.41%、13.76%、3.31%和54.56%，其中T4 降低水溶性鹽總量64.35%。表明土壤增施有機(jī)肥、生物菌劑和調(diào)理劑可提高表層土壤全氮和有效磷含量，顯著降低土壤水溶性鹽總量，而各調(diào)控措施間的土壤養(yǎng)分含量差異不顯著，其中T4 處理降低土壤水溶性鹽總量的效果最顯著。

表3 不同調(diào)控措施下的0 ～20 cm 土壤理化性質(zhì)Table 3 Physical and chemical properties of 0-20 cm soil under different control measures

2.3 不同調(diào)控措施對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

由表4 可知，不同調(diào)控措施表層土壤可培養(yǎng)微生物、細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均有T4 ＞T3 ＞T2＞T1。較T1 比，T2 的可培養(yǎng)微生物總數(shù)和放線菌數(shù)分別顯著提高17.96%和43.80%，T3 的可培養(yǎng)微生物、細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量、細(xì)菌/真菌比分別顯著提升91.89%、92.80%、59.81%、87.59%、19.81%，T4 的可培養(yǎng)微生物、細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量均增加1 倍左右，細(xì)菌/真菌比提高18.07%。說(shuō)明土壤增施生物菌劑、調(diào)理劑可改善表層土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量，其中T4 處理改善土壤微生態(tài)的效果最佳。

表4 不同調(diào)控措施下的土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量Table 4 The number of cultivable microorganisms in the soil under different control measures

2.4 不同調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌群落Alpha 多樣性的影響

對(duì)土壤樣品中的16S rDNA 基因的V3 ～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共獲得細(xì)菌有效序列320 522 個(gè)，這些序列在97%的相似性水平上被劃分為1 545 ～1 748 個(gè)OTU，土壤細(xì)菌文庫(kù)覆蓋率99%。不同調(diào)控措施的土壤細(xì)菌多樣性O(shè)TU 數(shù)量、Chao1 指數(shù)、ACE 指 數(shù) 有T4 ＞T3 ＞T2 ＞T1，反 映 出T4 和T3 處理的物種豐度明顯高于T1 和T2。Shannon 和Simpson 指數(shù)反映出T4 的物種多樣性最高，其次是T2 和T3，T1 的物種多樣性最低。表明土壤增施生物菌劑和土壤調(diào)理劑明顯提高表層土壤的細(xì)菌群落多樣性，其中T4 效果最佳（表5）。

表5 不同調(diào)控措施下的土壤細(xì)菌群落Alpha 多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index of soil bacterial communities under different control measures

2.5 不同調(diào)控措施對(duì)土壤細(xì)菌群落豐度及組成的影響

圖1 表明，當(dāng)測(cè)序量超過(guò)60 000 條時(shí)，整個(gè)曲線趨于平緩，表明該測(cè)序文庫(kù)已經(jīng)達(dá)飽和。不同處理用不同顏色表示，不同顏色圖形之間交疊部分?jǐn)?shù)字為兩個(gè)處理之間共有的特征個(gè)數(shù)（OTU 數(shù)目）。不同調(diào)控措施處理的共有細(xì)菌OTU 數(shù)量為972，T1、T2、T3、T4 的特異性細(xì)菌OTU 數(shù)量分別為1、3、40、320，T4 處理的特異性細(xì)菌OTU 數(shù)量最多。

圖1 不同調(diào)控措施下的土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序文庫(kù)稀釋曲線及VennFig. 1 The dilution curve and Venn of the high-throughput sequencing library of soil bacterial communities under different control measures

由圖2 可知，在門(mén)水平下，不同調(diào)控措施處理相對(duì)豐度最高的菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria），占32.36% ～41.69%， 隨后依次是酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）18.46% ～22.95%、 芽 單 胞 菌門(mén)（Gemmatimonadetes）4.36% ～9.32%、 放 線菌 門(mén)（Actinobacteria）5.27% ～7.96%、 綠 彎 菌門(mén)（Chloroflexi）2.66% ～10.63%， 厚 壁 菌 門(mén)（Firmicutes）0.19% ～14.37%，低于10% 的有擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）、浮 霉 菌 門(mén)（Planctomycetes）、 硝 化 螺 旋 菌 門(mén)（Nitrospirae）和其他。與T1 和T2 比，T3 和T4的放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)降低，而變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)豐度增加。

在目水平（圖2 右）下，不同調(diào)控措施處理相對(duì)豐度較高的菌目有uncultured_bacterium_c_Subgroup_6 占7.43% ～13.31%，鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）3.26%～7.60%，β-變形菌目（Betaproteobacteriales）4.77%～6.40%，芽單胞菌目（Gemmatimonadales）3.32%～6.55%，低于5%的有Tistrellales、己科河菌目（Rokubacteriales）、黏細(xì)菌目（Myxococcales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、梭菌目（Clostridiales）。與其他處理比，T4 的uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、鞘脂單胞菌目、芽單胞菌目、Tistrellales 下降，而梭菌目和根瘤菌目豐度增加。變形菌門(mén)含有豐富的固氮細(xì)菌，放線菌門(mén)多為致病細(xì)菌，厚壁菌門(mén)可以更好地分解土壤養(yǎng)分，表明增施土壤調(diào)理劑和微生物菌劑可增強(qiáng)固氮能力，提升土壤抵御外來(lái)病原體的能力。

圖2 門(mén)（左）和目（右）水平上最大豐度排名前10 的物種相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of the top 10 species with the largest abundance at the Phylum (left) and Order (right) levels

2.6 部分環(huán)境因子與主要細(xì)菌群落間的關(guān)系

采用冗余分析（RDA）法表明（圖3），兩個(gè)主要軸特征值分別為64.6%和26.38%，相關(guān)系數(shù)為0，RDA 分析結(jié)果可信。不同調(diào)控措施細(xì)菌群落變化差異明顯，T3 與T4 處理在第一排序軸的正端，T1 與T2 在第一排序軸的負(fù)端；T3 處理在第二排序軸的負(fù)端，其他處理在第二排序軸的正端。第一軸排序與土壤微生物總數(shù)呈正相關(guān)，與土壤水溶性鹽呈負(fù)相關(guān)。土壤水溶性鹽總量、有機(jī)質(zhì)與細(xì)菌群落中芽單胞菌門(mén)、己科河菌門(mén)等呈正相關(guān)，與互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）等具有負(fù)相關(guān)；土壤微生物總數(shù)與奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）、變形菌門(mén)呈正相關(guān)，與硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）等呈負(fù)相關(guān)。

圖3 不同調(diào)控措施部分環(huán)境因子與主要細(xì)菌群落（門(mén)水平）的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis of some environmental factors and main bacterial communities (Phylum level) of different control measures

3 討論

甜瓜連作種植和化學(xué)肥料過(guò)量施用造成土壤微生態(tài)環(huán)境失衡、病害嚴(yán)重和產(chǎn)量降低等，通過(guò)增施有機(jī)肥、微生物菌劑、土壤調(diào)理劑可改善土壤微生態(tài)環(huán)境、防治土傳病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)［17-18］。連作會(huì)引起土壤細(xì)菌含量下降、真菌數(shù)量上升，土壤從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致土壤性質(zhì)和土壤微生物多樣性改變，使碳、氮、磷養(yǎng)分循環(huán)受阻，土壤中有益細(xì)菌豐度降低和病原真菌豐度增加，病害增加［19］。本研究表明增施有機(jī)肥、微生物菌劑、土壤調(diào)理劑對(duì)提高土壤養(yǎng)分、減緩?fù)寥利}漬化、提升土壤可培養(yǎng)微生物、抑制土壤真菌化有顯著效果，其中T4 處理（復(fù)合肥配施有機(jī)肥+土壤調(diào)理劑+微生物菌劑）提高表層土壤全氮和有效磷分別達(dá)18.80%和45.77%，降低水溶性鹽總量54.56%，提升可培養(yǎng)微生物、細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量及細(xì)菌/真菌比值。T3 和T4 的變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)豐度增加，RDA 分析表明土壤水溶性鹽總量、有機(jī)質(zhì)、微生物總數(shù)均與微生物多樣性關(guān)系密切。霍朝晨和陳麗華等［20-21］研究發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)、水溶性鹽及微生物數(shù)量是影響土壤細(xì)菌群落的重要土壤因子。土壤調(diào)理劑中的天然礦物、酵母殘?jiān)筛纳仆寥澜Y(jié)構(gòu)，平衡酸堿性，提高保水保肥能力，降低土壤鹽漬化，有利于微生物生長(zhǎng)；微生物菌劑增加土壤有效活菌數(shù)，提高土壤微生物總數(shù)；有機(jī)肥為土壤微生物生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解，增加和平衡土壤養(yǎng)分含量［22-23］。微生物類群的增加，加速分解土壤中累積的對(duì)土壤環(huán)境有毒害的有機(jī)物，減輕連作效應(yīng)，降低枯萎病的發(fā)生［24］。有機(jī)肥、調(diào)理劑和微生物菌劑混合施用提高了表層土微生物數(shù)量，有效改善了微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性、豐富度，提升了表層土壤養(yǎng)分含量。以上是在無(wú)機(jī)復(fù)合肥和有機(jī)肥固定量基礎(chǔ)上的試驗(yàn)結(jié)果，添加有機(jī)肥、調(diào)理劑適當(dāng)減少無(wú)機(jī)復(fù)合肥用量的調(diào)控試驗(yàn)結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

不同調(diào)控措施平均增加土壤全氮和有效磷含量，減少土壤水溶性鹽富集。與復(fù)合肥配施有機(jī)肥（T1）相比，增施土壤調(diào)理劑（T2）增加了土壤微生物和放線菌數(shù)量，提升果實(shí)可溶性糖；增施微生物菌劑（T3）顯著增加土壤微生物、細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量，提升細(xì)菌/真菌比，提高果實(shí)可溶性糖含量；增施土壤調(diào)理劑和微生物菌劑的T4 處理改善土壤生物學(xué)性質(zhì)更明顯，在生產(chǎn)中建議推薦使用。最有效地增加了土壤微生物、細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量，提升細(xì)菌/真菌比，提高土壤細(xì)菌群落多樣性，增加變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）豐度，降低土壤水溶性鹽含量，果實(shí)可溶性糖增加，增產(chǎn)40.29%。因此，復(fù)合肥配施土壤調(diào)理劑和微生物菌劑改善土壤生物學(xué)性質(zhì)更明顯，在生產(chǎn)中建議推薦使用。