張世英，劉易超,，賈樹強，李泳潭，黃印冉，楊敏生，張 軍

（1.河北農業(yè)大學 林學院/河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000；2.河北省林業(yè)與草原科學研究院，河北 石家莊 050061；3.天津市寧河區(qū)苗木良種服務中心，天津 301509）

隨著全球氣候異常變化加劇，干旱問題在全球大部分地區(qū)愈加嚴峻，再加上溫室氣體排放量增加等原因，預計到21 世紀末全球氣溫將上升1.8 ～4.0 ℃［1］，部分地區(qū)的旱災頻率和嚴重程度都會隨之增加。水分在植物生長發(fā)育及分布的過程中至關重要，但當植物處于缺水環(huán)境下，不僅植物外部形態(tài)會受到影響，植物生理結構和生理生化代謝也會受到損害，且嚴重的干旱脅迫會造成植物不可逆轉的傷害，最終致使植物生命衰竭甚至死亡。

中華金葉榆(Ulmus pumila‘Zhonghua Jinye’) 為白榆的天然黃葉突變體，是河北省林業(yè)科學研究院培育的優(yōu)良觀賞品種，已在我國北方地區(qū)廣泛推廣應用［2-3］，其抗寒抗旱性強，能夠生長在寒冷、干旱的氣候環(huán)境之中，同時還具有較強的抗鹽堿性，可以說，中華金葉榆為目前國內彩葉樹種中應用最廣泛的樹種。目前，對中華金葉榆的研究報道較少，且已有的研究主要集中在葉片呈色［4-5］、嫩枝扦插［3］、繁育［6］、耐寒性［7-8］等方面。關于中華金葉榆耐旱性也有一些相關報道，但主要集中在干旱脅迫下苗木生長和保護酶等生理指標的響應上，對金葉榆適應干旱脅迫的分子機制探索較少，對其耐旱相關基因的發(fā)掘工作還不夠深入。本研究采用盆栽苗人工模擬控水法進行干旱脅迫處理，測定葉片相關生理指標，探究中華金葉榆幼苗對干旱脅迫的生理響應，利用轉錄組測序技術分析中華金葉榆受到干旱脅迫后葉片內基因表達變化，發(fā)掘相關抗旱基因，探索金葉榆抗旱的分子機制，為金葉榆栽培及推廣應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為通過扦插繁殖獲得的中華金葉榆幼苗，苗高約40 cm。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年8—9 月在河北省林業(yè)與草原科學研究院溫室大棚中進行，棚內溫度為25 ～35 ℃，空氣濕度為50%～70%。選取長勢一致的中華金葉榆幼苗移栽到新的有托盤的花盆中（上下口徑16 cm， 高17 cm），移栽后正常養(yǎng)護管理7 d，期間幼苗生長良好，之后將幼苗澆透水，自然干旱至重度脅迫處理所設定的土壤含水量后進行干旱處理，對照組和中度脅迫組分別補水至各自設定的土壤含水量。在脅迫的第0、10、20、30 天取樣。本試驗設3 個試驗組，每個試驗組內3 次重復，每個重復6 株，共18 株。水分梯度處理如下：對照組（CK）、中度脅迫組（MD）、重度脅迫組（SD）的土壤水分含量分別保持在田間持水量的80%、40%、20%。每天18：00 采用稱重法補水。

1.3 生理指標測定

相對電導率采用電導儀測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定［9］，可溶性糖（SS）含量采用蒽酮比色法測定［9］，可溶性蛋白（SP）含量采用考馬斯亮藍G-250 法測定［9］，各指標均為3次生物學重復。

使用Li-6400 便攜式光合儀（LI-COR，美國）于采樣日的9：00—11：00 選取植株中上部3 枚成熟葉片測定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣 孔 導 度（Gs）和 胞 間CO2濃 度（Ci），測 定系統(tǒng)采用開放式氣路，自然光源，有效光合輻射400 ～600 μmol/m2·s，室 內CO2濃 度 為400 μmol/mol，室內空氣流速為300 mL/min，3 次生物學重復。

1.4 轉錄組測序

采集脅迫第30 天的葉片，對照組和脅迫組各3個重復，共計9 個樣品，裝入離心管并標記（CK 組編號：CK-1、CK-2、CK-3，MD 組編號：MD-1、MD-2、MD-3，SD 組 編 號：SD-1、SD-2、SD-3），立即放入液氮中速凍，再轉移到-80 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩NA 的提取、質控、建庫及轉錄組的測序均由北京諾禾致源公司完成。

使用DESeq 軟件進行2 個比較組的差異表達分析，基于負二項分布模型確定差異表達，以 ｜log2fold change ｜＞1 和Padj ＜0.05 的基因指定為差異基因，同時利用clusterProfiler 軟件對篩選得到的差異基因進行GO 功能注釋和KEGG 富集分析。

1.5 qRT-PCR 分析

從MD-vs-CK 和SD-vs-CK 兩個比較組中隨機挑選8 個共有下調DEGs 進行qRT-PCR 分析，以驗證轉錄組測序結果。利用primer 5.0 軟件設計每個基因的特異性引物，內參基因為actin，引物信息見表1。利用反轉錄試劑盒將樣本的RNA 反轉錄成cDNA，利用MagicSYBR Mixture 試劑盒（康為世紀）進行qRT-PCR 試驗，PCR 擴增采用 20 μL 體系，包括2×MagicSYBR Mixture 10 μL，10 μmol/L 的上下游引物各0.4 μL，100 ng/μL 的cDNA 模 板1 μL，25 μmol/L 的ROX Reference Dye I30.2 μL，8 μL ddH2O，3 次生物學重復。PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共45 個循環(huán)。利用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物信息表Table. 1 Primer sequence for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對幼苗葉片相對電導率和丙二醛含量的影響

隨著干旱脅迫程度的增加和脅迫時間的延長，中華金葉榆幼苗的相對電導率（REC）和MDA 含量逐漸增加（圖1）。脅迫30 d 時，MD 和SD 下的REC 分 別 為68.92%、68.02%， 與CK 組 相 比分別顯著增加1.55 倍、1.78 倍。CK 組、MD 組和SD 組在脅迫30 d 的REC 較脅迫0 d 分別顯著增加了30.43%、233.09%、260.08%（ 圖1A）。SD 組在脅迫30 d 時的MDA 含量較CK 組的顯著升高107.23%。隨脅迫時間的延長，CK 組的MDA 含量無差異，MD 組和SD 組在脅迫30 d 時的MDA 含量較脅迫0 d 的分別顯著增加了0.90 倍、1.88 倍 （圖1B）。

圖1 干旱脅迫對中華金葉榆葉片相對電導率和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effect of drought stress on relative conductivity and MDA content of Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ leaves

2.2 干旱脅迫對幼苗葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

干旱脅迫導致中華金葉榆幼苗葉片中的SS 含量 升 高，脅 迫10 d 時，SD 組 的SS 含 量 迅 速 增加。MD 和SD 處理30 d 后，中華金葉榆幼苗葉片SS 含量分別較對照顯著增加57.04%、70.14%（圖2A）。CK 組的SS 含量僅在脅迫30 d 時較脅迫0 d 的顯著增加19.82%。MD、SD 組在脅迫30 d 時的SS 含量較脅迫0 d 分別顯著增加88.16%、103.86%。

隨脅迫時間的延長，脅迫組和CK 組的SP 含量均先升高后降低（圖2B）。SD 組在第10 天時，SP 含量迅速升高，第20 天時達到峰值，較對照增加93.37%，第30 天時急劇下降。CK 組、MD 組和SD 組在脅迫20 d 時的SP 含量較脅迫0 d 的分別顯著增加29.48%、85.07%、150.37%。

圖2 干旱脅迫對中華金葉榆葉片滲透調節(jié)物質含量的影響Fig. 2 Effect of drought stress on the content of osmotic adjustment substances of Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ leaves

2.3 干旱脅迫對幼苗葉片光合參數(shù)的影響

隨著干旱脅迫程度的增加和脅迫時間的延長，中華金葉榆幼苗葉片的Pn、Tr和Gs均逐漸降低。SD 組的Gs在脅迫進行到第30 d 時趨近于零，較對照顯著降低90.91 %，如圖3A、B、C 所示；Ci變化趨勢與前3 項指標不同，隨著脅迫程度的增加和時間的延長，Ci呈先降低后增加的趨勢（圖3D）。CK 組和MD 組在脅迫30 d 時的Pn脅迫0 d 時分別顯著降低30.96%、68.02%。SD 組在脅迫10 、20、30 d 的Pn、Tr、Gs均 較 脅 迫0 d 的 顯 著 降 低，Ci僅在脅迫30 d 時較脅迫0 d 的顯著升高37.70%。

圖3 干旱脅迫對中華金葉榆葉片光合參數(shù)的影響Fig. 3 Effects of drought stress on photosynthetic parameters of Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ leaves

2.4 轉錄組數(shù)據(jù)質控分析

經(jīng)高通量測序后，如表2 所示，CK、MD、SD的平均原始數(shù)據(jù)分別為44 117 769、43 701 319、44 529 946 bp，經(jīng)過過濾后的平均質控數(shù)據(jù)為42 686 075、43 701 319、44 529 946 bp，Q20 平 均 達 到97.90%、98.20%、98.17%，Q30 平均達到93.87%、94.50%、94.39%，GC 含量平均分別為45.50%、45.50%、45.47%。以上結果說明，本次測序所得cDNA 文庫質量高，可進行后續(xù)生物信息學分析。

表2 轉錄組測序產(chǎn)出質量統(tǒng)計Table 2 Transcriptome sequencing output quality statistics

2.5 干旱脅迫下中華金葉榆葉片的差異基因表達分析

MD 與CK 相比（MD-vs-CK），共有661 個DEGs，其中上調表達的差異表達基因（DEGs）420個，下調表達的DEGs 241 個。隨著脅迫程度的增加，DEGs 的數(shù)量也快速增加。SD 與CK 相比（SD-vs-CK），共有1 945 個DEGs，上調表達和下調表達的DEGs 分別有793 個和1 152 個，如圖4 所示。由韋恩圖可知，兩種脅迫處理的DEGs 中共有表達的DEGs 有179 個，MD 下特有表達的DEGs 有482個，SD 下特有表達的DEGs 有1 766 個。

圖4 中度及重度干旱脅迫處理的中華金葉榆葉片轉錄組差異基因表達數(shù)Fig. 4 Transcriptome differential gene expression numbers of Ulmus pumila ‘Jinye’ leaves treated with mild and severe drought stress

2.6 差異表達基因的GO 功能注釋及富集分析

MD-vs-CK 組中DEGs 的GO 功能注釋表明，共 有625 個DEGs 注 釋 到 生 物 過 程（Biological Process，BP）、細 胞 組 分（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（Molecular Function，MF）3 大類中的447 個亞類，包括244 個BP 亞類的243 個DEGs，24 個CC 亞類的75 個DEGs，179 個MF 亞類的307 個DEGs。主要涉及生物過程中光合作用（13 個）、化學反應（11 個），細胞組分中膜蛋白復合物（11 個）、光合膜（9 個）、光系統(tǒng)（9 個），分子功能中糖基水解酶活性（21 個）、四吡咯結合（21個）（圖5A）。

在SD-vs-CK 組中，共有2 036 個DEGs 富集到GO 注釋的696 個亞類中，包括349 個BP 亞類的779 個DEGs，100 個CC 亞 類 的218 個DEGs，247 個MF 亞類的1 039 個DEGs。主要涉及生物過程中碳水化合物代謝過程（75 個）、肽生物合成過程（58 個）、肽代謝過程（58 個），細胞組分中細胞質部分（71 個）、細胞內非膜細胞器（59 個）、非膜細胞器（59 個），分子功能中結構分子活性（54個）（圖5B）。

圖5 中度及重度干旱脅迫處理的中華金葉榆葉片轉錄組DEGs 的GO 分類Fig. 5 GO classification of DEGs in the leaves transcriptome of Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ treated with mild and severe drought stress

2.7 差異表達基因的KEGG 功能注釋及代謝通路富集分析

2 種脅迫處理的KEGG 富集通路的top20 如圖6 所示。MD-vs-CK 中（圖6A），富集因子最高的是光合作用、氧化磷酸化、倍半萜和三萜生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、玉米素的生物合成，其中光合作用的DEGs 數(shù)目最多，有23 個，其次是氧化磷酸化及氨基糖和核苷酸糖代謝，分別為13 個和12 個。

SD-vs-CK 中（圖6B），富集因子前三名依次是核糖體、淀粉和蔗糖代謝、糖鞘脂的生物合成系列。此外，富集的DEGs 最多的是核糖體通路，有68 個，其次是氨基酸的生物合成通路上注釋的DEGs 有39個，淀粉和蔗糖代謝與苯丙烷生物合成代謝通路上富集的DEGs 均為30 個。

圖6 中度及重度干旱脅迫處理的中華金葉榆葉片轉錄組DEGs 的KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of DEGs in the leaves transcriptome of Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ treated with mild and severe drought stress

2.8 qRT-PCR 驗證

從MD-vs-CK 和SD-vs-CK 2 個比較組中挑選8 個共有下調DEGs，進行qRT-PCR 驗證。結果表明（圖7），8 個DEGs 均下調表達，與RNA-Seq數(shù)據(jù)的基因表達趨勢相同，表明轉錄組結果可靠性較高。

圖7 干旱脅迫下8 個共有下調DEGs 的qRT-PCR 分析Fig.7 qRT-PCR analysis of 8 common down-regulated DEGs under drought stress

2.9 干旱脅迫下關鍵差異表達基因分析

MD-vs-CK 和SD-vs-CK 2 個比較組中有179個共有DEGs，這些基因稱為關鍵DEGs，對關鍵DEGs 進行KEGG 通路分析，結果表明：關鍵DEGs 共富集到38 條通路上，被分為Metabolism、Genetic Information Processing、Environmental Information Processing 和Organismal Systems 4 大類，主要富集到光合作用、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、玉米素的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝通路。對光合作用通路下的DEGs 作熱圖分析（圖8），發(fā)現(xiàn)有4 個共有基因（novel.1、Upu6G00578、Upu9G00160和novel.1821）富集到此通路，且這4 個基因與對照相比，表達量都上調，基因注釋發(fā)現(xiàn)，novel.1、Upu9G00160和novel.1821這3 個基因參與光合系統(tǒng)PS Ⅱ過程，Upu6G00578參與F 型ATP 酶合成過程，編碼atpB 蛋白。

圖8 光合作用差異表達基因熱圖Fig.8 Heat map of differentially expressed genes in photosynthesis

對MD-vs-CK、SD-vs-CK 兩個比較組光合作用通路中的DEGs 進行分析，發(fā)現(xiàn)與此通路相關的DEGs 有63 個，有13 個基因顯示差異表達，包含10 個上調DEGs 和3 個下調DEGs（表3）。在27 個基因編碼的PS Ⅱ系統(tǒng)相關的psb 家族中，有6個基因呈現(xiàn)差異表達；其中psbA和psbD基因分別編碼PS ⅡP680 反應中心D1 蛋白和D2 蛋白，是PS Ⅱ的主要功能蛋白，參與光電子傳遞過程中的原初反應，提供電子傳遞鏈輔因子的結合位點；psbB和psbC基因分別編碼PS ⅡCP47 和PS ⅡCP43 葉綠素蛋白，這2 個基因與反應中心的D1 和D2 蛋白連接緊密，具有捕獲外周天線葉綠素a/b 結合蛋白的激發(fā)能反饋給反應中心及核心天線的功能及維持PS Ⅱ放氧核心復合物結構的作用；這4 個基因均上調表達。psbW和psbY基因分別編碼PS ⅡPsbW 蛋白和PS ⅡPsbY 蛋白，這2 個基因下調表達。

表3 干旱脅迫下中華金葉榆幼苗光合作用通路的差異表達基因信息Tab. 3 Differentially expressed gene information of photosynthesis pathway in Ulmus pumila ‘Zhonghua Jinye’ seedlings under drought stress

在編碼PS Ⅰ系統(tǒng)相關的psa基因家族有16 個基 因，包 含2 個 上 調DEGs（psaA、psaB），這2 個蛋白主要形成PS Ⅰ反應中心。編碼細胞色素b6-f 復合物和光合電子傳輸相關蛋白的pet 家族有12 個基因，有petA（編碼細胞色素f）和petD基因（編碼細胞色素b6-f 復合物Ⅳ亞基）呈現(xiàn)上調表達，僅有1 個下調表達petH 基因（編碼鐵氧還蛋白-NADP還原酶）。有8 個基因編碼F 型ATP 酶，其中有2個F 型H+/Na+轉運ATPase 亞基（atpA、atpB）呈現(xiàn)上調表達。

3 討論

干旱環(huán)境傷害細胞膜的透性，損傷膜蛋白，打破植物體內的氧化平衡，導致MDA 大量積累和電解質外滲［10］，引起植株失水甚至死亡。MDA 和相對電導率分別是反映膜脂過氧化作用和衡量細胞膜透性的重要指標，能反映植物的抗旱能力［11］。本研究表明，隨脅迫程度的加劇和時間的延長，MDA含量和相對電導率逐漸上升，與前人研究一致［12-13］。表明持續(xù)干旱脅迫降低幼苗葉片組織的保護能力衰退，破壞細胞膜的結構和功能，脂膜過氧化嚴重受損。SS 和SP 是常見的滲透調節(jié)物質，具有穩(wěn)定細胞滲透壓和保護細胞膜結構等功能［14］。本研究中，隨脅迫程度的增加和時間的延長，SS 和SP 總體上升，與江登輝等［15］的研究一致，但SP 含量在脅迫30 d 時降低，表明干旱時間過長抑制蛋白質的合成并誘導降解，葉片代謝異常，最終降低滲透調節(jié)作用。

干旱脅迫下植物Pn值降低的原因是氣孔因素或非氣孔因素［16］。植物在短期干旱脅迫下光合作用降低主要是氣孔因素，為了降低蒸騰、保持水分從而關閉氣孔，因此Gs降低、Tr降低，引起Pn降低［17］。本研究中，脅迫前10 d，氣孔關閉使Gs下降，并阻礙外界的CO2進入細胞，造成Pn降低，這是由氣孔限制引起的光合作用水平降低；而脅迫10 d 后，Gs、Tr和Pn仍降低，Ci升高，此時是由非氣孔因素引起的Pn下降。在脅迫30 d 時，SD 下的Pn與CK 組的差別不大，表明幼苗在干旱環(huán)境下仍保持較高的光合水平，具有較強抗旱性。有研究表明，植物的滲透調節(jié)能力對維持光合水平有重要作用［18］，本研究也驗證了這一點，因此，中華金葉榆幼苗在干旱環(huán)境下維持較高的Pn，可能是滲透調節(jié)物質發(fā)揮作用。

轉錄組學是連接基因組遺傳信息和蛋白質組功能信息的橋梁，也是了解生物基因表達調控的工 具［19］。本研究對經(jīng)過不同程度干旱脅迫的幼苗葉片進行轉錄組測序，分別得到661 個和1 945 個DEGs響應中度和重度脅迫，可能是脅迫程度的加重使幼苗產(chǎn)生了更多的DEGs 來抵御逆境產(chǎn)生的傷害。

GO 分析表明，干旱脅迫下幼苗DEGs 主要涉及在參與膜蛋白復合物、光合膜、細胞質部分和細胞內非膜細胞器的細胞組分中，部分DEGs 富集在行使光合作用和碳水化合物代謝的生物過程上，并在糖基水解酶活性和結構分子活性中起重要作用。與本研究結果不同，扭果花旗桿的DEGs 主要富集與細胞壁有關的功能中［20］，而馬鈴薯莖段的DEGs主要在氧化還原過程、氧化還原酶活性及激素響應等功能上富集［21］，可能是脅迫方式的差異或不同植物材料耐旱性的區(qū)別導致了這種差異。KEGG 分析表明，MD 和SD 顯著富集到苯丙烷生物合成通路，此途徑在植物生長發(fā)育、生物或非生物脅迫中發(fā)揮作用，與扭果花旗桿［24］和烤煙品系LY1306［22］在SD 下的研究結果一致。同時發(fā)現(xiàn)DEGs 在玉米素的生物合成通路均也顯著富集，這與趙龍等［21］對馬鈴薯莖段的研究結果類似。

轉錄組測序可以反應出植物在特定環(huán)境下的基因表達情況，目前人們已對白榆［23-24］進行轉錄組測序，挖掘出相應的基因資源，本研究是對干旱脅迫下的中華金葉榆幼苗葉片進行測序和分析，得到了參與光合作用途徑的多個差異基因，同時測定了干旱脅迫下幼苗的生理生化指標，可為提高金葉榆耐旱性和栽培及推廣應用提供理論支持。

4 結論

中華金葉榆遭受干旱脅迫時，會提高滲透調節(jié)物質的含量來適應干旱脅迫。通過對中度和重度脅迫組的179 個共有關鍵DEGs 進行KEGG 通路分析，獲得光合作用、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、玉米素的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝等通路，這可為解析中華金葉榆對抗干旱脅迫的生理和分子機制提供參考。