田盼麗，尚 濤，李紅梅

近年血漿同型半胱氨酸(Hcy)的研究受到廣泛關注。多項研究表明血漿同型半胱氨酸水平升高可引起冠心病等動脈粥樣硬化性心腦血管疾病，但其中發(fā)病機制尚未明確。我們研究在大鼠去勢后，血漿同型半胱氨酸水平升高是否可通過氧化應激途徑發(fā)揮致動脈粥樣硬化作用效應及葉酸治療是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料：FA (folic acid,上海玉博生物科技有限公司)，F(xiàn)A純度>99%；Hcy ELISA 試劑盒：上海玉博生物科技有限公司，批號為CSB-E08896r；TAC、GSH-Px及MDA試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及模型建立：于蘭州大學醫(yī)學院購買健康SD大鼠32只，均為4月齡雌性鼠，體重220～260 g。在無菌條件下，OVX組、MET組、FA組實驗大鼠被給予戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，雙側(cè)卵巢通過下腹正中切口被切除，以上3組的輸卵管及卵巢伴行血管被結(jié)扎，沖洗閉合傷口。其余8只保留卵巢，只切除相同大小的卵巢周圍脂肪組織，作為SHAM組。

1.2.2 分組及處理：①假手術組(SHAM組);②去勢組(OVX組);③蛋氨酸負荷組(MET組)：大鼠摘除卵巢后一周，使用蛋氨酸1 mg/(kg·d)灌胃;④葉酸治療組(FA組)：去卵巢+蛋氨酸灌胃，給予葉酸20 mg/(kg·d)腹腔注射。去勢1周后，SHAM、OVX組給予蒸餾水灌胃，剩余2組給予蛋氨酸灌胃，F(xiàn)A組給予葉酸干預治療，共持續(xù)9周。

1.2.3 血清同型半胱氨酸測定：以上干預10周后行腹主動脈穿刺取血，分離血清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中同型半胱氨酸水平。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD)，計算樣品濃度，按照試劑盒的說明書具體操作。

1.2.4 血清氧化應激指標測定均按照試劑盒說明進行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清Hcy水平：與SHAM組比較，OVX組血清同型半胱氨酸濃度顯著升高(P<0.05)；給予蛋氨酸灌胃，MET組的Hcy濃度進一步升高(P<0.05)；葉酸治療可顯著降低血清Hcy濃度(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清Hcy水平

2.2 各組大鼠血清TAC、GSH-Px和MDA的變化：與SHAM組相比，OVX組血清TAC、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA濃度明顯升高(P<0.05)；給予蛋氨酸負荷，MET組血清TAC、GSH-Px活性進一步降低(P<0.05)，而MDA濃度進一步升高，葉酸治療可增強TAC、GSH-Px活性，降低MDA濃度(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清TAC、GSH-Px、MDA濃度的比較

3 討論

女性進入更年期后，血漿雌二醇水平下降的同時，也會出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[1-2]。大鼠去卵巢后給予蛋氨酸負荷，蛋氨酸在體內(nèi)通過腺苷轉(zhuǎn)移酶及甲基轉(zhuǎn)移酶等作用代謝為同型半胱氨酸而使血漿中同型半胱氨酸水平進一步升高[3]。近年來發(fā)現(xiàn)HHcy是心血管疾病的獨立危險因素，可致動脈粥樣硬化[4-5]。該實驗結(jié)果表明，摘除卵巢后雌性大鼠的血漿Hcy濃度升高，去卵巢大鼠給予蛋氨酸負荷9周，可充分誘導高同型半胱氨酸血癥。

抗氧化與促氧化之間的失衡可引起氧化應激。TAC及GSH-Px是抗氧化的指標，前者反映機體總的抗氧化能力；后者可以使氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽；MDA是氧化應激的產(chǎn)物，其水平上升說明脂質(zhì)過氧化作用增強。HHcy等因素可降低機體抗氧化作用，促進氧化反應的發(fā)生，損傷全身多處組織細胞[6]，通過多種途徑促進炎癥反應的發(fā)生，并可抑制細胞內(nèi)的正常信號傳導及加快細胞的死亡和凋亡等。有實驗表明[7]同型半胱氨酸可降低細胞內(nèi)GSH-Px的濃度，增強脂質(zhì)過氧化物與H2O2的細胞損傷效應。目前認為[7]Hcy可能通過以下途徑誘導ROS生成：①Hcy結(jié)構(gòu)中的巰基活性較強，可氧化產(chǎn)生H2O2和O2-；②Hcy可能通過線粒體途徑、NADPH氧化酶途徑促進活性氧生成；③Hcy降低超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化酶的數(shù)量和活性。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢后抗氧化指標總抗氧化力、谷胱甘肽過氧化酶下降，而丙二醛升高，即去卵巢本身即可導致機體氧化應激的發(fā)生。切除卵巢的大鼠再給予蛋氨酸負荷后，血清總抗氧化力、過氧化酶谷胱甘肽的水平進一步下降，而丙二醛進一步升高，說明蛋氨酸負荷加重了去卵巢大鼠的氧化應激損傷。經(jīng)相關分析表明，大鼠血清同型半胱氨酸濃度與抗氧化物血清總抗氧化力、谷胱甘肽過氧化酶呈顯著負相關，與丙二醛呈顯著正相關。近年來，葉酸的研究及臨床使用受到了廣泛的關注，其作為一種新型的抗氧化劑，在顯著降低血漿Hcy水平的同時，也改善了機體的氧化應激損傷。本實驗結(jié)果表明，與MET組大鼠比較，葉酸可顯著升高TAC、GSH-Px水平，顯著降低MDA水平，增強抗氧化體系能力，具有抗氧化作用。這與國內(nèi)學者蔣興亮等[8]發(fā)現(xiàn)血漿同型半胱氨酸水平升高的患者中，其超氧化物歧化酶水平低于正常對照組，血漿丙二醛水平則明顯高于正常對照組的結(jié)論一致。

綜上所述，本研究觀察了去勢大鼠給予蛋氨酸負荷后，血漿同型半胱氨酸及氧化應激標志物水平的改變以及給予抗氧化劑葉酸后上述指標的改變。結(jié)果表明去卵巢大鼠經(jīng)蛋氨酸負荷后血漿Hcy水平及氧化產(chǎn)物升高，抗氧化能力下降，葉酸可逆轉(zhuǎn)高同型半胱氨酸癥引起的氧化應激損傷。同時也證明了去卵巢大鼠動脈粥樣硬化發(fā)生進展中有氧化應激的參與，故葉酸作為一種新型抗氧化劑可能為動脈粥樣硬化的防治提供了一個新思路。