夏文洋 ，徐顯睿 *，李翠鳳 ，張宗博 ，張衡，陳政言

1. 青島根源生物技術(shù)集團有限公司食品研究室（青島 266000）；2. 青島諾和諾康實業(yè)有限公司（青島 266000）

乳酸菌是生產(chǎn)酸奶、風(fēng)味發(fā)酵乳、發(fā)酵乳飲料、干酪、常溫酸奶等發(fā)酵乳制品最重要的菌株。乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵特性（包括產(chǎn)酸、產(chǎn)香、蛋白分解能力、質(zhì)構(gòu)特性）直接影響發(fā)酵乳制品的品質(zhì)[1-3]。在實際生產(chǎn)中不同發(fā)酵乳產(chǎn)品所需發(fā)酵劑特性一般不同，尤其以殺菌型發(fā)酵乳產(chǎn)品對發(fā)酵劑性能要求較高，如常溫酸奶和殺菌型乳飲料均需發(fā)酵劑產(chǎn)酸快，后酸化平緩，產(chǎn)丁二酮或乙醛等典型香氣，賦予發(fā)酵乳極高黏稠度，使產(chǎn)品風(fēng)味口感飽滿，降低離心沉淀率。生產(chǎn)濃縮乳飲料需發(fā)酵劑具有長時、持續(xù)高產(chǎn)酸能力，對產(chǎn)黏性能無特殊要求；制備干酪通常選擇產(chǎn)黏低或不產(chǎn)黏，產(chǎn)香和蛋白分解能力較強的發(fā)酵劑，有利于乳清處理和干酪成熟。因此，試驗以8種常見市售商業(yè)酸乳發(fā)酵劑為研究對象，結(jié)合發(fā)酵劑中菌株構(gòu)成，對發(fā)酵劑在產(chǎn)酸、產(chǎn)香、蛋白分解能力、質(zhì)構(gòu)和感官指標進行測試，分析不同乳酸菌菌株發(fā)酵特異性，旨在為提高發(fā)酵劑應(yīng)用適宜性和產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂奶粉、全脂奶粉（脫脂奶粉蛋白質(zhì)濕基含量33%，全脂奶粉蛋白質(zhì)濕基含量25%，新西蘭恒天然公司）；蔗糖（食品級，市售）；丁二酮（國藥集團化學(xué)試劑公司）；鄰苯二甲醛、三氯乙酸、亞硫酸氫鈉（天津科密歐化學(xué)試劑公司）；直投發(fā)酵劑YOMIX 883、YO-MIX161、008LYO（美國杜邦公司）；直投式發(fā)酵劑YC-X11、LH-B02、L.casei01、YOFLEX Express1.0（丹麥科漢森公司）；直投發(fā)酵劑YBS 381（青島根源生物技術(shù)集團有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TAX-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀（英國Stable Micro Systems公司）；iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀（法國AMS Alliance公司）；R50A高速乳化剪切機（上海弗魯克科技發(fā)展有限公司）；AH-BASIC高壓均質(zhì)機（加拿大ATS公司）；HWS-24電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

稱取45 g脫脂奶粉和55 g全脂奶粉（蛋白含量2.9%），加純水溶解（55 ℃、30 min），定容至1 000 g，均質(zhì)（65 ℃、20 MPa），水浴殺菌（95 ℃、5 min），冷卻（37～43 ℃）接入發(fā)酵劑，發(fā)酵至pH 4.6±0.5，于4 ℃后熟24 h后備用。

1.3.2 發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測定

將不同發(fā)酵劑按1.3.1方法制備發(fā)酵乳，于37～43 ℃發(fā)酵24 h（以商品發(fā)酵劑最適發(fā)酵溫度計），采用iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀測試期間連續(xù)pH。

1.3.3 發(fā)酵劑產(chǎn)丁二酮含量測定[4-5]

1.3.3.1 丁二酮標準曲線的繪制

取15 μL丁二酮溶于蒸餾水中，定溶至500 mL。分別量取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL丁二酮標準溶液于12支并排放置 的試管中，分別用蒸餾水補足10 mL。向前排 試管中加0.5 mL 1%的鄰苯二胺溶液，后排試 管不加鄰苯二胺溶液，充分混勻于黑暗處使其反應(yīng)30 min，加4.0 mol/L鹽酸進行終止反應(yīng)，前排試管加2.0 mL 4.0 mol/L的鹽酸，后排試管加2.5 mL，搖勻后用后排試管作為空白對照，用紫外分光光度計在335 nm波長下測定吸光度。以丁二酮濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2 丁二酮含量的測定

取待測乳樣品，與16%三氯乙酸溶液等體積混合，混勻后靜置10 min，按3 500g離心10 min后，取上清液，用濾紙將上清液過濾，確保其澄清。取20 mL上清液，等體積分別加入到2個試管中，向1號試管中加0.5 mL 1%鄰苯二胺溶液，2號試管不加，充分混勻后于黑暗處使其反應(yīng)30 min，向2個試管中加入4.0 mol/L的鹽酸進行終止反應(yīng)，1號試管加2.0 mL，2號試管加2.5 mL，混勻后用2號試管作為對照液，用紫外分光光度計在335 nm波長測定吸光度。如果樣品中丁二酮含量較高，測得的吸光度超過0.2～1.0的范圍，可用8%三氯乙酸對樣品進行適當?shù)南♂屘幚?。對照標準曲線計算出樣品中丁二酮含量，若樣品經(jīng)稀釋，則乘稀釋倍數(shù)得到丁二酮含量。

1.3.4 發(fā)酵劑產(chǎn)乙醛含量測定[6]

取5 mL 1% NaHSO3溶液于250 mL錐形瓶中，加入25 mL處理后上清液，混勻后室溫下放置1 h，加入1 mL 1%淀粉溶液，用0.01 mol/L碘液滴定至淡藍紫色，并且在30 s內(nèi)淡藍紫色不褪去，加入20 mL 1 mol/L NaHCO3，充分振蕩混勻，用0.01 mol/L碘液滴定至藍紫色終點，使溶液藍紫色消失，記錄消耗標準碘液的體積，乙醛含量（mg/L）按式（1）計算。

式中：V2為滴定空白消耗碘標準溶液體積，mL；V1為滴定樣品消耗碘標準溶液體積，mL；C為碘標準溶液濃度，mol/L；25為樣品稱樣量，mL；0.022為乙醛反應(yīng)化學(xué)基本單位，μg。

1.3.5 發(fā)酵劑蛋白水解能力測定

1.3.5.1 酪氨酸標準曲線繪制

配制成10 mmol/L酪氨酸標準溶液。用蒸餾水將該溶液濃度分別稀釋為0，2，4，6，8和10 mmol/L的標準溶液。取75 μL上述酪氨酸溶液，加入3 mL的OPA反應(yīng)液[7]，充分混勻后，室溫放置2 min，在340 nm波長下用石英比色杯測定其吸光度。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)水解能力測定[8-9]

取75 μL經(jīng)三氯乙酸處理過的發(fā)酵乳樣品加入中試管中，加入3 mL的OPA反應(yīng)液，混勻后室溫放置2 min，在340 nm波長下用分光光度計測定其吸光度。

1.3.6 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性測試

按1.3.1中方法制備酸乳，采用TAX-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測定產(chǎn)品硬度、稠度、黏聚性。測定條件：選用A/BE探頭，壓力盤直徑35 mm。設(shè)置參數(shù)：下降速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，提升速度10.0 mm/s，測試深度30 mm，記錄整個過程中所需應(yīng)力。探入過程中的最大峰值為硬度，探頭上行的負峰值為黏聚性，曲線正峰面積為稠度。

1.3.7 酸乳總酸度測定

稱取10 g酸乳樣品置于錐形瓶中，加入20 mL冷卻至室溫的蒸餾水混勻，加入2滴0.5%的酚酞指示劑，混勻后用氫氧化鈉標定溶液滴定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色，讀取消耗氫氧化鈉標準溶液體積（V），酸度（°T）按式（2）計算。

式中：C為氫氧化鈉標定溶液的摩爾濃度，mol/L。

1.3.8 發(fā)酵乳感官評價

將不同發(fā)酵劑按1.3.1方法制備發(fā)酵乳，于4 ℃后熟24 h后測定酸度，并選擇10名具有感官評定經(jīng)驗的食品專業(yè)人員進行評分，方法如表1所示。

表1 發(fā)酵乳感官評價標準

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測定結(jié)果

由圖1可知，不同發(fā)酵劑在24 h產(chǎn)酸性能差異顯著。發(fā)酵劑YO-MIX 883，YC-X11，YO-MIX 161，YBS 381，008LYO和YOFLEX Express1.0產(chǎn)酸趨勢基本相同，其中發(fā)酵劑YOFLEX Express1.0在6 h使發(fā)酵乳降至pH 4.5后仍具有較強產(chǎn)酸性能，24 h使發(fā)酵乳降至pH 3.5，而其他5種發(fā)酵劑均產(chǎn)酸較快，5～7 h使發(fā)酵乳降至pH 4.5左右且后酸化較平緩。

圖1 發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測試

發(fā)酵劑LH-B02，L.casei01產(chǎn)酸速度相對較慢，發(fā)酵24 h的發(fā)酵乳在pH 4.3左右。

乳酸菌產(chǎn)酸性能是選擇發(fā)酵劑的主要指標[10]，傳統(tǒng)發(fā)酵劑是由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共同組成[11]，在發(fā)酵初期嗜熱鏈球菌在乳中快速生產(chǎn)并產(chǎn)生甲酸、丙酮酸和二氧化碳等促進保加利亞乳桿菌生長，保加利亞乳桿菌細胞表面蛋白酶又將酪蛋白分解為短肽和氨基酸進而促進嗜熱鏈球菌生長[12]。Hutkins等[13]研究表明嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌對酸的敏感性不同，pH低于5時，嗜熱鏈球菌生長受到抑制，而保加利亞乳桿菌在pH 3.5時才對酸表現(xiàn)敏感，此外郭清泉等[14]和Beal等[15]研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌是導(dǎo)致后酸化水平較低的主要菌株。試驗中供試發(fā)酵劑除LH-B02和L.casei01外，其他6種發(fā)酵劑均以嗜熱鏈球菌或保加利亞乳桿菌為優(yōu)勢菌，與上述產(chǎn)酸機理和產(chǎn)酸性能測試結(jié)果基本一致。

2.2 不同發(fā)酵劑產(chǎn)丁二酮含量測定結(jié)果

由圖2可知，發(fā)酵劑YC-X11，YBS 381產(chǎn)丁二酮能力最強，含量分別為7.37和6.36 μg/mL，其次為發(fā)酵劑YO-MIX 161和YOFLEX Express1.0，產(chǎn)丁二酮含量為6.06和5.99 μg/mL。YO-MIX 883，008LYO和L.casei01產(chǎn)丁二酮含量在3.58～5.03 μg/mL之間，而LH-B02產(chǎn)丁二酮能力最弱，為2.55 μg/mL。

圖2 發(fā)酵劑產(chǎn)丁二酮含量測定結(jié)果

丁二酮是酸乳重要的特征風(fēng)味之一，可賦予酸乳類似堅果的奶油香氣，顯著改善發(fā)酵乳風(fēng)味[16]。由試驗可初步得出，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別作為優(yōu)勢菌群產(chǎn)丁二酮能力較強，均優(yōu)于干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，與俞本杰[17]研究結(jié)果一致。冷佳[18]研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌的產(chǎn)丁二酮能力較強。賀家亮等[19]測得瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌組合產(chǎn)丁二酮含量最多，這主要與不同種屬菌株間產(chǎn)香能力具有菌株特異性有關(guān)[20]，此外供試發(fā)酵劑中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同作用可能比單株干酪乳桿菌或瑞士乳桿菌發(fā)酵積累更多風(fēng)味物質(zhì)[21]。

2.3 不同發(fā)酵劑產(chǎn)乙醛含量測定結(jié)果

由圖3可知：發(fā)酵劑LH-B02產(chǎn)乙醛能力最強，含量為24.16 μg/mL；YO-MIX 883和008LYO產(chǎn)乙醛含量最低，僅13.06和14.87 μg/mL；其余5種發(fā)酵劑產(chǎn)乙醛能力相差不大，乙醛含量在17.33～21.55 μg/mL之間。

圖3 發(fā)酵劑產(chǎn)乙醛含量測定結(jié)果

乙醛是發(fā)酵乳中最具有代表性的風(fēng)味物質(zhì)，可賦予酸乳清爽的芳香味，是評價酸乳風(fēng)味的重要指標[22]。有研究表明糖代謝途徑是產(chǎn)生乙醛主要途徑，另一種重要合成途徑是丙酮酸在α-羧化酶或醛脫氫酶催化下直接生成乙醛，但在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌中沒有檢測到上述關(guān)鍵酶[23-24]，因此以嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為優(yōu)勢菌的發(fā)酵劑產(chǎn)乙醛能力低于瑞士乳桿菌可能與此有關(guān)。

2.4 不同發(fā)酵劑蛋白水解能力測定結(jié)果

由表2可知：發(fā)酵劑LH-B02和YOFLEX Express1.0蛋白水解能力最強，游離氨基酸含量分別為4.45和4.20 mmol/L；發(fā)酵劑L.casei01水解蛋白能力較強，游離氨基酸含量為3.58 mmol/L；其余5種發(fā)酵劑水解蛋白產(chǎn)生游離氨基酸的含量差異不明顯，YO-MIX 883蛋白水解能力最弱，游離氨基酸含量為1.97 mmol/L。

表2 不同發(fā)酵劑蛋白水解能力測定結(jié)果

有研究表明瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌的蛋白水解能力最強，而嗜熱鏈球菌蛋白水解能力一般較低[25]，與發(fā)酵劑LH-B02（瑞士乳桿菌）、YOFLEX Express1.0（保加利亞乳桿菌為優(yōu)勢菌）和YO-MIX 883（嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢菌）試驗結(jié)果相同。蘇媛寧等[26]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌的蛋白水解能力較強，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌則表現(xiàn)較低水平，也與本試驗結(jié)果一致。此外，呂家平等[27]發(fā)現(xiàn)某些嗜熱鏈球菌株的蛋白水解能力較干酪乳桿菌相差并不大，該觀點從發(fā)酵劑YBS 381測試結(jié)果也進行了驗證，這可能與菌株特異性有關(guān)。

2.5 不同發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

由表3可知，不同發(fā)酵乳pH在4.60±0.5時，8種發(fā)酵劑的發(fā)酵乳在硬度、稠度和黏聚性方面差異顯著。發(fā)酵劑YO-MIX 883，YO-MIX 161和YBS 381在硬度、稠度和黏聚性方面表現(xiàn)突出，其中YO-MIX 883發(fā)酵乳的硬度和黏度最高，YBS 381的發(fā)酵乳最稠厚，其他5種發(fā)酵劑的發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性則相對較小。

表3 不同發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

有研究表明發(fā)酵乳的硬度、稠度、黏聚性基本呈正向關(guān)[8]，菌株產(chǎn)黏性強，發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)指標相對較高[28]。通常能高產(chǎn)胞外多糖的菌株稱為黏性菌株，干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌均能代謝產(chǎn)生胞外多糖，而嗜熱鏈球菌在產(chǎn)胞外多糖方面性質(zhì)穩(wěn)定，對提高發(fā)酵乳流變性、穩(wěn)定性、質(zhì)感和持水性有重要意義[29]，而上述質(zhì)構(gòu)表現(xiàn)突出的發(fā)酵劑均以嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢菌，與之前研究結(jié)論相符合。

2.6 不同發(fā)酵乳感官評價結(jié)果

由表4可知，發(fā)酵劑YO-MIX 883、YO-MIX161、008LYO、YC-X11、YBS381的發(fā)酵乳感官評分較高，而發(fā)酵劑LH-B02、L.casei01、YOFLEX Express1.0的發(fā)酵乳感官評價一般，尤其在組織狀態(tài)和風(fēng)味方面接受度偏低。

表4 不同發(fā)酵劑發(fā)酵乳感官評價結(jié)果

由2.5小節(jié)的結(jié)果可知，5種感官評分較高發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)指標，尤其黏聚性顯著高于其他3種發(fā)酵劑。有研究表明發(fā)酵乳必須具有較好的入口黏度才能得到消費者較高的評價[30]，與試驗結(jié)果一致。此外發(fā)酵劑LH-B02，L.casei01的發(fā)酵乳酸度較高，且黏度較低可能導(dǎo)致酸感在口腔釋放度增強，影響口感，掩蓋發(fā)酵風(fēng)味；發(fā)酵劑YOFLEX Express1.0使感官質(zhì)量下降原因可能主要與保加利亞乳桿菌在后熟期間酸度增長較快，嚴重刺激味覺，影響發(fā)酵乳品質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論

對市售8種酸乳發(fā)酵劑在產(chǎn)酸率、產(chǎn)香能力（丁二酮、乙醛）、蛋白水解能力、質(zhì)構(gòu)特性（硬度、稠度、黏聚性）和感官作為評價指標進行發(fā)酵特性測試。其中，以嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢菌發(fā)酵劑（YO-MIX 883、YC-X11、YO-MIX 161、YBS 381、008LYO）產(chǎn)酸較快，5～8 h可使發(fā)酵乳降至pH 4.5，后酸平緩，產(chǎn)丁二酮能力最高可達7.37 μg/mL，發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性最高可達硬度139.45 g、稠度3 701.57 g·s、黏聚性-103.78 g，且感官評分都較高。其中，以瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌為優(yōu)勢菌發(fā)酵劑（LH-B02、YOFLEX Express1.0）產(chǎn)乙醛和蛋白水解能力較強，含量分別可達24.16 μg/mL和4.45 mmol/L。該試驗為提高發(fā)酵劑開發(fā)不同種類酸乳產(chǎn)品的適宜性、改善酸乳產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。