楊宇辰，鄢貴龍， ，楊依晶，姚佳怡，王志倩

1. 淮陰師范學院生命科學學院（淮安 223300）；2. 江蘇省食品質量安全與營養(yǎng)功能評價重點建設試驗室（淮安 223300）

近年來，鑒于環(huán)境污染問題日益嚴重和石化資源的不可再生性，尋找一種可持續(xù)再生的工業(yè)綠色原材料成為人們的研究熱點[1-2]，而世界上分布最廣、存量最大的可再生資源木質纖維素成為人們的理想原料來源。然而，木質纖維素復雜的結構形成了很強的生物化學利用屏障，它導致了木質纖維素分解困難，難于進一步利用[3-4]。為了降低這種抗性，使木質纖維素易于分解，通常需要對木質纖維素進行預處理，在預處理過程中通常使用化學或機械的方式來降低木質纖維素復雜結構，再進行水解，只有當這些聚合物被水解成低聚物或單體時，才能夠利用它們來生產人們所需的各種燃料、化學品和材料。

為了提高木質纖維素的利用率，人們已經對許多生物質預處理方法進行了廣泛的研究，并開發(fā)出了各種有效的預處理方法[5-6]，如稀酸預處理[7]、稀堿預處理[8]、蒸汽爆破[9]、氨纖維爆破[10]等。但是這些方法在預處理過程中可能會產生大量的二次污染物，而且還會形成后續(xù)微生物發(fā)酵的抑制物[5]，因此研究人員不斷地尋找更優(yōu)的方法。近年出現的離子液體，可高效溶解纖維素、半纖維素和木質素，為生物質組分的分離提供了一種新方法。但是由于其存在制備成本高、有毒性和難回收等缺點，限制了離子液體在木質纖維素預處理中的進一步應用[11-12]，因此探索新型綠色的木質纖維素預處理方法是十分必要的，其中環(huán)境友好的低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）在生物質高值化中的應用逐漸得到了國內外研究人員的關注。

低共熔溶劑通常由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）之間相互作用形成，DESs是可再生的、易大量合成的新型綠色溶劑，并且具有低成本、低毒性和可生物降解等優(yōu)點，已經在化學合成、電化學、提取分離、功能材料制造等方面有著廣泛的應用[13-14]。近年來，DESs在木質纖維素的預處理中也有大量的研究報道[15-16]，結果表明，DESs可以高效、高純度地提取植物纖維中的木質素，并可有效去除半纖維素，是一種較理想的木質纖維素預處理溶劑。為了更好地利用DESs在木質纖維素預處理中的應用，試驗以玉米芯為原料，考察不同的氯化膽堿（ChCl）類低共熔溶劑在玉米芯預處理中對其組分分離效果的影響，篩選出高效的預處理溶劑，為木質纖維素的利用提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

氯化膽堿、草酸、丙三醇、乳酸、乙二醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、木糖（國藥集團化學試劑有限公司）；纖維素酶Ctec2、半纖維素酶Htec2（諾維信生物技術有限公司）。

玉米芯，采集自江蘇淮安市，將其風干，粉碎后過0.600 mm篩，室溫儲存于密閉容器中。

1.2 主要儀器與設備

757 CRT紫外/可見分光光度計（上海精密科學儀器廠）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；MC-30S高壓滅菌器（日本ALP公司）；5410離心機（德國Eppendorf公司）；inifinte1260高效液相色譜（配備G1312C雙泵、G1322A脫氣機、G1362A RID檢測器、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱和Chemstation工作站，美國Agilent公司）。

1.3 低共熔溶劑的合成：

按表1的摩爾比分別稱取一定質量的氯化膽堿和其他試劑加入三角瓶中，在80 ℃或常溫下使用磁力攪拌器攪拌至溶液清亮透明，即得各種低共熔溶劑。

表1 DES溶劑組成及其氫鍵供體pKa值

1.4 玉米芯低共熔溶劑預處理

將2.00 g粉碎的玉米芯與20.00 g DES混合，并在油浴中磁力攪拌處理所需時間后，冷卻至室溫，加入40 mL無水乙醇，混勻后過濾，濾餅再用40 mL無水乙醇洗滌抽濾2次，最后用50 mL純水洗滌抽濾1次，預處理后玉米芯冷凍干燥后備用。

1.5 酸水解

酸水解方法參考NERL方法[17]并進行了一定的修改。取100.0 mg預處理后的玉米芯于10 mL玻璃管中，再加入1 mL 72%硫酸，于30 ℃水浴鍋中水解1 h后，加28 mL純水混勻后置于滅菌鍋內，于121 ℃水解1 h，取出冷卻后，上清液以分光光度法測定酸溶性木質素，同時用HPLC測定糖含量，濾渣分析酸不溶性木質素含量。

1.6 酶水解

取50.0 mg預處理后的玉米芯于2 mL離心管中，再加入1 mL酶液（酶液用pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制，纖維素酶、木聚糖酶濃度分別為15和7.5 mg蛋白/g生物質），然后在旋轉混合器上于50 ℃恒溫水解72 h。反應結束后，沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫以10 000 r/min離心，上清水解液過濾后用HPLC測定水解液中各糖的含量。

1.7 糖含量的測定

水解液中糖含量采用高效液相色譜法。色譜條件：Biorad HPX-87H色譜柱，進樣量為20 μL，流動相為5 mmol/L稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，示差檢測器的溫度為35 ℃。

2 結果與討論

2.1 DES預處理后玉米芯質量及形態(tài)變化

以不同氫供體與氯化膽堿形成的DES處理粉碎后的玉米芯，在不同溫度條件下玉米芯的質量回收率和形態(tài)變化分別見圖1和圖2。

圖1 不同溫度下DES預處理后玉米芯的回收率

圖2 不同溫度下DES預處理后玉米芯的形態(tài)變化

由圖1可以看出，對于草酸、甲酸、乳酸等酸類氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系，玉米芯預處理后的固體物質回收率隨著反應溫度的升高而下降，這一結果可能意味著，更高的溫度會導致碳水化合物的更多降解和木質素的更高去除率。其他的研究也獲得類似結果，酸類氫供體組成的DES體系對生物質的溶解性更大，而且隨著溫度的升高固體物質的得率下降[18-19]。由圖1也可發(fā)現，對于由酸性氫供體組成的氯化膽堿DES體系，隨著氫供體酸性的增強，固體物質的回收率也有下降趨勢，這可能是由于相對低的酸度能更有效地破壞木質素等大分子之間的連接[20]，從而將更多固體物質溶解于DES體系中。圖2結果也進一步說明了這一可能結果。從圖2可以看出，隨著溫度的升高，預處理后的玉米芯顏色逐漸變深，在80 ℃時，預處理后的玉米芯顏色比未處理的變淺了，而當預處理溫度為140 ℃時，酸類為氫供體的氯化膽堿類DES處理玉米芯后，玉米芯顆粒被分散，而且顏色變黑，說明玉米芯中的物質發(fā)生了較多的化學反應，生成了較多的深色成分，可能不利于其中糖類的利用。對于由乙二醇、甘油為氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系，隨著溫度的升高，玉米芯的損失量變化不明顯。據文獻報道，氯化膽堿與多元醇組成的DES體系，由于更多羥基的存在會形成更強的分子間氫鍵，其穩(wěn)定性更強，黏度更高，這需要更多的能量來降低其黏度并使其結構松散，從而有利于滲透到木質纖維素中并與之相互作用[21]。這一結果說明，由酸性氫供體與氯化膽堿組成的DES能較多地溶解玉米芯中的成分，而由醇類氫供體與氯化膽堿組成的DES對玉米芯中物質的溶解性較弱。

2.2 DES預處理后玉米芯化學成分的變化

生物質預處理的主要目的是去除木質素和半纖維素等成分，盡可能保留纖維素成分，同時提高纖維素對酶的可水解性。因此，試驗考察了不同DES在80，100，120和140 ℃下對玉米芯預處理的效果，并分析了不同DES處理對玉米芯化學組成變化的影響，結果如圖3，圖4和圖5所示。

由圖3可以看出，不同組成的DES在不同溫度下處理玉米芯后，其成分含量有較大的區(qū)別。由草酸、甲酸、乳酸等氫鍵供體組成的DES體系預處理后，固體殘渣中的葡聚糖隨著處理溫度的升高有升高的趨勢，當溫度由80 ℃升至140 ℃時，甲酸、乳酸與氯化膽堿組成的DES處理玉米芯后，其葡聚糖分別由32.18%提高至53.21%，以及31.55%提高至55.19%，但是由草酸組成的DES在此溫度范圍內殘渣葡聚糖變化不大，其值在48.43%～50.56%之間。殘渣中葡聚糖含量的提高可能是由于經過預處理后，生物質中木質素、半纖維素等成分的脫除而引起的，這一結果可以從圖4和圖5中得出。由圖4和圖5可以看出，3種酸性DES隨著處理溫度的提高，葡聚糖對于原料的回收率在76.26%～93.10%之間，表明葡聚糖在DES預處理中相對穩(wěn)定[22]。與葡聚糖相比，木聚糖的回收率經3種酸性DES處理后，隨著溫度的升高幾乎呈線性的降低，特別是在草酸組成的DES體系中回收率更低。在140 ℃時，木聚糖在草酸、甲酸和乳酸與氯化膽堿組成的DES體系處理后的回收率分別為2.14%，17.04%和24.94%，許多文獻[22-24]也報道了類似的結果。此外，對于3種酸組成的DES體系，木質素的去除率和木聚糖的變化類似，隨著溫度的升高，木質素的去除率明顯升高，其中酸可溶性木質素的去除率均大于酸不溶性木質素的去除率。然而，對于由乙二醇、甘油與氯化膽堿組成的DES體系，在80～140 ℃溫度范圍內，預處理后玉米芯的組成變化不明顯，其葡聚糖的回收率均在90%以上，而木聚糖的回收率也在89%以上，雖然在140 ℃時，甘油組成的DES處理后酸可溶性木質素的去除率達16.63%，乙二醇組成的DES處理后酸不溶性木質素去除率達15.21%，但是因這兩種木質素在玉米芯中含量相對較低，所以其對預處理后的玉米芯組成整體影響較小。Procentese等[25]報道對于甘油與氯化膽堿組成的DES體系，只有在高溫（150 ℃以上）下長時間處理，否則單獨用于生物質預處理的效果不明顯，與此次試驗的結果相一致。

由圖3，圖4和圖5可以看出，溫度是影響DES處理生物質效果的重要因素，提高溫度有利于降低DES體系的黏度，增強DES溶劑的滲透性，同時溫度的升高，DES溶劑的分子運動加劇，從而破壞木質素、半纖維素和纖維素之間形成的復雜氫鍵網絡，溶解生物質的部分木質素、半纖維素和纖維素[21]。但是由于氯化膽堿與多元醇組成的DES體系存在更強的分子間氫鍵，其在試驗條件下對玉米芯進行預處理的效果并不明顯。

圖3 DES預處理后和未處理玉米芯部分成分含量

圖4 DES預處理后葡聚糖回收率

圖5 DES預處理后木聚糖、可溶性木質素和酸不溶性木質素去除率

研究結果表明，氯化膽堿為氫受體的DES體系，木聚糖的去除率及木質素去除率與其氫供體的pKa值呈正相關性[26-28]。由圖4和圖5可以看出，隨著DES氫供體pKa值降低，DES體系酸度逐漸變弱，氫供體給出質子的能力增強，因此其攻擊木質素、半纖維素和纖維素之間形成的復雜氫鍵網絡能力也增強，從而提高了木聚糖、木質素的去除能力，這一結論也與文獻報道相一致[20，26]。

從試驗結果來看，草酸、甲酸和乳酸為氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系更適合于預處理玉米芯，用其預處理后，處理后的玉米芯可以獲得較高的葡聚糖含量，同時有效地降低了木質素和木聚糖等半纖維素成分，有利于后續(xù)的酶解過程，提高酶解效率。

2.3 DES預處理后對玉米芯酶水解的影響

酶水解結果通常被認為是評價生物質預處理效率的重要標準[19]。因此，對5種不同的DES預處理后的玉米芯與未處理玉米芯進行了酶水解試驗，測定了預處理后生物質中葡聚糖酶水解率及原料中葡聚糖經預處理后酶水解后的回收率。結果如圖6和圖7所示。

圖7 DES預處理后原料葡聚糖酶水解回收率

由圖6可以看出，未處理玉米芯原料的酶水解率較低，只有13.07%，而經過DES預處理后酶的水解率均有不同程度的提高，這可能是由于經DES預處理后，去除了部分木質素、半纖維素等成分，降低了纖維素結晶結構，使生物質結構變得疏松，提高了對酶的水解性能[29]。其中草酸和甲酸與氯化膽堿組成的DES溶劑在100 ℃預處理玉米芯后能獲得最高的酶水解率，分別為55.87%和47.54%。隨著溫度的升高，其水解率反而下降，這可能是因為在更高的溫度下，纖維素發(fā)生其它的化學反應，生成了一定的酶水解抑制物。這2種DES預處理后酶水解的葡萄糖對原料回收率也是在100 ℃時最高，與酶水解率變化趨勢相同。由乳酸、乙二醇及甘油與氯化膽堿的組成的3種DES溶劑，隨著預處理的溫度升高，其酶水解率和葡萄糖的回收率也隨之升高，Procentese等[25]也報道了類似的結果。但是乙二醇及甘油與氯化膽堿的組成的2種DES溶劑預處理后，其值變化不明顯。溫度由80 ℃提高至140 ℃時，其酶水解率由22.86%升高至32.33%，由19.07%升高至27.97%，相對較低的酶水解率可能是由其較低的木質素和半纖維素等去除率引起的。乳酸與氯化膽堿組成的DES溶解預處理玉米芯后，其酶水解率和葡萄糖回收率均有明顯的提高，酶水解率由80 ℃的36.90%提高至140 ℃時的94.11%，葡萄糖回收率也由34.35%提高至85.00%，這一結果可能是由于溫度升高，木質素和半纖維素等的去除率增加，從而提高了酶對纖維素的可及性，降低了木質素等對酶的無效吸附，同時在較高溫度下預處理反應體系中沒有生成酶抑制物。由以上結果可以得出，ChCl-OA（1∶2）DES體系在140 ℃時預處理玉米芯可以獲得較高的酶水解率和葡萄糖回收率，是玉米芯預處理較好的一種綠色溶劑。

圖6 DES預處理后葡聚糖酶水解率

3 結論

DES作為生物質預處理的潛在綠色溶劑正被日益關注著，然而在使用時還需針對不同生物質原料進行DES溶劑體系的篩選和工藝優(yōu)化。試驗以預處理后生物質組分變化及預處理后對酶水解效率的影響評價了5種以氯化膽堿為氫鍵受體的DES。結果發(fā)現，3種有機酸為氫鍵供體的DES溶劑體系更適合處理玉米芯，而且溫度和氫鍵供體的pKa值對預處理結果有重要影響，木質素和木聚糖等去除率隨著溫度升高而增大，pKa值的降低也有利于木質素、木聚糖等半纖維素類物質的去除。以乙二醇、甘油為氫鍵供體的氯化膽堿DES體系在140 ℃以下預處理玉米芯效果較差。試驗結果表明，氯化膽堿/乳酸組成的DES溶劑是玉米芯預處理的較好體系，它能有效地去除玉米芯中半纖維素和木質素，同時保持很高的葡萄糖回收率。研究結果為發(fā)展一種具有更好的經濟前景和環(huán)境友好型加工方法提供了一定的參考。