李國斌

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

亞麻（Linumusitatissimum），屬亞麻科（Linaceae）亞麻屬（Linum）1年生草本植物，其內部含有35%～ 45%的油，亞麻籽油在烹飪、制藥、化妝品和醫(yī)學方面受到歡迎，主要是因為其含有高水平的不飽和脂肪酸，即油酸和亞油酸，還有將亞麻籽油轉化成其他有價值的產品如生物燃料的應用前景[1]。

亞麻籽油傳統(tǒng)上是通過液壓擠壓和溶劑提取獲得，主要是用正己烷作為溶劑，利用機械方法或加熱方法能夠顯著提高該過程的產率[2]。種子的碾磨大幅提高效率，因為這一操作破壞植物細胞，增加傳質的界面面積[3-4]。有利于油釋放的另一種方法則是通過適當?shù)拿覆糠炙鈦喡樽鸭毎?，獲得高提取產率的亞麻籽油[5-6]。以往研究表明，對于不同種子，使用酶輔助預處理顯示微弱的促進效果，即與未經處理的樣品相比，提取產率提高2%～12%[7-8]。如此小的改進使得研究人員放棄了這一方面的調查研究。然而，以往研究只考慮較短的反應時間（一般為15～120 min），缺少對長時間酶處理的研究。

植物細胞被一個由碳水化合物分子（纖維素、半纖維素和果膠多糖）和蛋白質組成復雜的細胞壁基質所包圍。為獲得更高的出油率，酶制劑應該具有廣泛的活性以破壞細胞壁結構；此外，蛋白質在遠離等電點pH的溶解也會破壞基質的穩(wěn)定，加速油進入溶劑相的過程[9]。有報道稱，纖維的存在阻止酶進入蛋白質。在酶促水解中加入纖維素酶和果膠酶，在更長的時間內，可使蛋白酶更容易接觸蛋白質，從而提高消化率?？傊斂紤]到幾種酶類型的協(xié)同活性時，預測可以獲得更好的提取產率。

試驗通過將纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的混合物輔助提取亞麻籽油開展研究。采用酶法進行前處理，探究pH、濃度、溫度、反應時間、顆粒大小等條件對亞麻籽油提取產率的影響，以期為酶預處理法在提高亞麻籽油提取產量中的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

亞麻籽（2009年9月在中國云南產區(qū)收獲的紅色品種亞麻中收集）；根據(jù)亞麻籽的結構組成，選擇4種不同類型的酶，分別為纖維素酶（No. 22178，由黑曲霉制得）、半纖維素酶（木葡聚糖，No. X2753）、果膠酶（No. P2611，由棘孢曲霉產生）、蛋白酶（No. 93614，由豬胰腺產生），均購自Fluka Sigma- Aldrich公司；其他試劑均為分析純或更高純度。

1.2 試驗流程和方法

1.2.1 種子制備、粉碎和篩選

在亞麻酒發(fā)酵過程中轉移亞麻汁時收集種子，并通過傾析和篩分從果肉和果皮中分離出來。第1次清洗去除漂浮在水面上未成熟的顆粒。在至少3 d內，在4 ℃下用磁棒輕輕攪拌下，將種子用水（200 g/L）洗滌幾次，1 d換2次水，直到觀察到最低恒定濁度。將凈化后的種子用乙醇洗滌，在室溫（約25 ℃）風干，并在使用前在4 ℃儲存。在國內咖啡機上進行研磨，將顆粒分為幾種標準篩分（＜0.50，0.50～0.60，0.60～0.71，0.71～1.0，1.0～1.4，1.4～2.0和＞2.0 mm）。

1.2.2 酶化處理

基于前期研究，在所有試驗中，酶化懸浮液與種子之比保持在等于4 mL/g（干基）。用檸檬酸和磷酸氫鈉的緩沖溶液固定pH。10 g粉碎的種子用酶促纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶和果膠酶的混合液進行處理。反應在200 r/min的連續(xù)攪拌下等溫進行，并通過用液氮冷凍懸浮液來停止。通過冷凍干燥燒瓶中的內容物除去水。

1.2.3 亞麻籽油的提取

使用150 mL正己烷在索氏提取器（50 mL容量；23 mm×100 mm筒）中進行常規(guī)萃取4 h。之前的測試表明，4 h就足以確保最大限度地提取，此外，為確保合成油不攜帶水，提取的樣品在真空下通過G1燒結玻璃過濾器中的無水硫酸鈉，并在30 ℃下在旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)回收溶劑。將油轉移到快速真空管中，通過離心蒸發(fā)進行干燥。干燥后的亞麻籽油稱取其質量，計算其提取產率（用η表示）。該過程的產量以從100 g干亞麻籽中提取的油量表示。

1.2.4 試驗設計

分析幾個變量對萃取產率的影響，即反應時間（t）、溫度（T）、pH、粒徑（dp）以及酶促混合液的濃度（C）。反應時間為8，16，24，48和120 h；溫度為30，40和50 ℃；pH范圍為3～7；粒徑為1.0～1.4 mm和小于0.5 mm；研究2組濃度，分別為C1（纖維素酶=29 U/g、蛋白酶=1 191 U/g、木聚糖酶=21 U/g和果膠糖酶=569 U/g）和C2（纖維素酶=72 U/g、蛋白酶= 2 977 U/g、木聚糖酶=55 U/g和果膠素酶=1 708 U/g）。

2 結果和討論

2.1 反應時間對提取產率影響分析

分別討論反應時間、pH、溫度、酶濃度和粒徑對提取產率的影響。在圖1中，觀察到η隨時間的增長趨勢，在反應時間為8，16，24，48和120 h時，測定的增量（用D表示）為8.9%，19.5%，46.5%，60.2%和136%。結果表明，提取產率隨著時間推移而持續(xù)增加。在較短時間內，提取產率的提升不夠明顯。值得注意的是，大多數(shù)酶前處理的研究只考慮較小的反應時間（一般為0.25～2 h），因增量低于15%，故導致酶處理和酶提取同時進行的研究一般顯示出相當令人失望的結果。8 h后，與對照組相比，僅實現(xiàn)一個很小的增量D=8.86%，但在24 h內，其值達到46.5%，明顯超過大多數(shù)早期的研究。當反應時間延長到120 h時，提取產率提高達到163%。由于24 h時，提取增量隨時間呈二次方變化，而后出現(xiàn)拐點，因此24 h被認為是時間長度和提取產率提高（46.5%）之間的折中點，盡管其他參數(shù)尚未被考慮和優(yōu)化。

圖1 不同提取時間對提取產率影響

2.2 pH對提取產率影響分析

遠離等電點的值會使蛋白質組學基質不穩(wěn)定，能促進種子油的去除，且蛋白質本身會受到pH調節(jié)的影響，故本試驗研究pH對提取產率的影響分析。其他的參數(shù)設定在t=24 h，T=40 ℃，dp=1.0～1.4 mm，濃度C1。每一種酶都有一個最佳的pH，其性能最高。當幾種酶在相同的條件下共同作用時，可能會產生不同行為。不同種酶的pH為：果膠酶，pH 3.5；纖維素酶，pH 5；半纖維素酶，pH 4～6；蛋白酶，pH 7.6。由于找到合適的pH存在難度，也對此進行研究。

根據(jù)圖2顯示的結果，評估最高pH測試的最小增量（pH 7），其中η=8.65%，D（產率增量）=29.9%。對于其他的pH，測量到更好的結果，即pH 5的D= 57.7%，pH 4的D=106%和pH 3的D=107%。由此可以得出結論，D穩(wěn)定在pH 4附近，它達到三位數(shù)，并開始接近pH 6時達到的極端值t=120 h（D=136%）。

圖2 不同提取pH對提取產率影響

在pH 4，果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶明顯受到青睞，而蛋白酶不在最佳pH范圍內?？赡苁羌毎诨|變形的協(xié)同效應及酶活性造成上述顯著增量的原因[10]。

2.3 反應溫度對提取產率影響分析

總的來說，對于溫度的影響，文獻的報道并不一致。雖然在一些油籽案例中，溫度是一個基本參數(shù)，它也被證明在其他方面沒有顯著影響。試驗發(fā)現(xiàn)了相當大的增量，即D=45.2%在30 ℃，D=46.5%在40 ℃，和D=0.751%在50 ℃。

反應溫度對提取產率影響的試驗結果如圖3所示，與對照組相比，隨著反應溫度的提高，亞麻籽油的提取產率增加，在反應溫度40 ℃是提取產率達到最大值，在50 ℃時沒有增加（D=0.751%）反而降低，這表明雖然高溫不會影響油本身的質量，但在高溫下可能使一些酶已經喪失活性，從而降低它們的回收和再利用的可能性。故選擇反應溫度為40 ℃為最佳的提取溫度。

圖3 不同反應溫度對提取產率影響

2.4 酶處理濃度對提取產率影響分析

在其余的參數(shù)與基礎情況一致，即t=24 h，T=40 ℃、pH 6和dp=1.0～1.4 mm的基礎上，研究酶濃度的影響，結果如圖4所示。對于濃度水平C2，結果與對照組相比，有顯著改善：η=12.0%和D=80.2%，而在濃度水平C1時僅增強D=46.5%。

圖4 不同酶處理濃度對提取產率影響

濃度C2時，首先確定pH對提取產率的影響。再確定所有其他參數(shù)（反應時間、溫度、平均粒徑、水籽比和攪拌速率）與基本情況一致。

pH 4～7時，濃度C2的η變化的趨勢與濃度C1時接近。在pH 3時，沒有檢測到由于濃度而增加的增量，因為D（C1）=107%≈D（C2）=110%。結果表明，pH 4為最佳pH，與未處理的材料相比，最大的提取產率達到137%。

必須強調的是，濃度可能會掩蓋其他參數(shù)。實際上，高濃度可能會抵消其他非優(yōu)化變量的微弱影響。如較高的反應時間需要較低的酶濃度，反之亦然。因此，應該始終提出一個最適方案，因為酶的成本是酶處理的經濟可行性的基礎?？紤]到濃度C2的成本幾乎是濃度C1的2倍或3倍，D（C1，pH 4）=106%和D（C2，pH 4）=137%，首選低濃度C1。

2.5 粒徑對提取產率影響分析

亞麻籽的機械處理對提取產率有很大影響，因為它打破了植物細胞壁，增加了亞麻籽油提取產率。因此，粒徑越小，提取產率就越高。然而，在工業(yè)加工上并不推薦，因為在工業(yè)上加工如此精細的粉末，對含油量高、結構弱的材料在暴露于溶劑流中時會坍塌并失去其大孔性，從而降低了均勻性和滲透性。故本試驗研究粒徑對亞麻籽油的提取產率的影響。

使用未處理的磨削樣品（即對照組試驗）測定dp的影響。相應地，對于dp=1.0～1.4 mm，η=6.66%（如圖5所示），當dp＜0.5 mm時，產率為13.5%（圖5），這個值比前者高出130%，突出粒徑對油籽可提取性的作用[8]。

大多數(shù)早期關于酶處理的研究沒有考慮粒徑，完成水處理時，完整的種子經常浸入水介質中并原位研磨，沒有進一步分類。然而，這個參數(shù)絕對不可忽視，當比較已處理/未處理樣品的結果時，會得出誤導的結論。為研究dp對酶反應的影響，試驗條件采用先前分析的條件，即t=24 h、T=40 ℃、pH 4和濃度C1。并且進行粒徑小于0.5 mm的試驗，考慮與對照2進行比較。

當顆粒dp＜0.5 mm時，η=19.5%，即比對照1增加D=193%。由于酶作用導致，帶來的理論上的增強明顯小于這個值，因為η=19.5%只比對照2多了27.5%（圖5）。這個結果是由于這個事實許多較小顆粒的油體在研磨后已經暴露出來[9]。盡管如此，酶的處理在dp＜0.5 mm仍有其意義。

圖5 不同樣品粒徑對提取產率影響

3 結論

通過機械和酶預處理的結合，可以提高亞麻籽油提取產率。雖然機械加工會產生更快、更便宜的結果，但在工業(yè)層面上處理小粒直徑有限。這一事實促使針對酶處理對增加亞麻籽油提取的影響開展研究。

試驗表明，濃度和處理時間增加后產量會增加。相比之下，pH和溫度則是先增后降。關于酶混合液的濃度，所研究的最低水平（即纖維素酶29 U/g、蛋白酶1 191 U/g、木聚糖酶21 U/g和果膠酶569 U/g）取得積極結果。盡管如此，還是必須進行精確的經濟評估，以便根據(jù)酶的成本而選擇適當?shù)臐舛?。關于粒徑，酶處理對較大的直徑有更大的影響?？傮w上，提出亞麻籽油提取的優(yōu)化參數(shù)：t=24 h、pH 4、溫度30～40 ℃、顆粒直徑范圍1.0～1.4 mm，濃度C1。在這些條件下，提取產率為13.7%，比未處理的樣品增加106%。在t=120 h、pH 4、T=40 ℃、dp=1.0～1.4 mm，濃度C1時，得到最佳提取產率17.5%，增量為163%。這一研究表明采用酶促預處理法具有數(shù)量優(yōu)勢，能增強亞麻籽油提取產率，為酶預處理法在提高亞麻籽油提取產率中的應用提供借鑒。