戴富才，趙娣，李紅美，蘇月月，景學(xué)敏，張曉軒

廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（廊坊 065000）

菝葜（Smilax china）為百合科植物菝葜屬，又名金剛藤、金剛刺，主要分布于我國長江以南及東南亞等地。菝葜根、莖、葉 均可入藥，菝葜中主要包含氨基酸、茋類、皂苷類、黃酮類、酚酸類等各種化學(xué)成分，具有祛風(fēng)利濕、消腫解毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化等作用[1]。

綠原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeicacid）與奎尼酸（quinicacid）組成的縮酚酸，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降糖、增加白細(xì)胞數(shù)量等多種生理作用[2]。綠原酸主要從金銀花[3]、杜仲[4]等天然產(chǎn)物中提取。市場上綠原酸供應(yīng)不足，導(dǎo)致綠原酸價格居高不下。所以擴(kuò)大綠原酸的提取來源并研究其提純工藝十分有必要。試驗選取菝葜為綠原酸提取的植物來源。

綠原酸的提純方法主要有水提醇沉、石灰乳沉淀法、膜分離法、重結(jié)晶法、溶劑萃取法、離子交換樹脂法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法和大孔樹脂分離等方法[5]。其中，大孔樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，便于工業(yè)化生產(chǎn)，在綠原酸的分離與富集中被廣泛應(yīng)用。沈奇等[6]選用NKA-9大孔樹脂來分離蒲公英中的綠原酸，提純后，綠原酸提取物純度可達(dá)25.3%。大孔樹脂對菝葜中綠原酸的提純工藝尚未見報道，因此，如何以菝葜為原料，研究大孔樹脂提純綠原酸的工藝，成為我們研究的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菝葜（產(chǎn)自河北省保定市）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司）；大孔樹脂NKA-Ⅱ、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5、D101等（分析純，天津市精細(xì)化工研究所）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市渤化化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜（配自動進(jìn)樣器和紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；XFB-400高速中藥粉碎機(jī)（湖南吉首市中湘制藥機(jī)械廠）；KQ-250B超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1640A電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；酒精計（河北省武強(qiáng)紅星玻璃儀表廠）；TD4臺式低速離心機(jī)（湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菝葜中綠原酸的HPLC檢測方法

1.3.1.1 HPLC法檢測條件[7]

色譜柱為SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，色譜純乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比隨時間變化見表1）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長327 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 乙腈與磷酸水溶液的體積比隨時間變化表

1.3.1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制及工作曲線的繪制

精確稱取5.0 mg綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用50%的色譜純甲醇溶解并定容于25 mL的棕色容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。于4 ℃左右保存，待用[8]。

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL，用高效液相色譜法測定峰面積。以綠原酸的質(zhì)量濃度為橫向坐標(biāo)，液相色譜的峰面積為縱向坐標(biāo)，繪制綠原酸的工作曲線，并計算其線性方程[9]。

取所需待測的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，用于高效液相色譜分析[10]。

1.3.2 菝葜綠原酸吸附率、解吸綠、得率、含量和產(chǎn)率

按式（1）～（5）計算[4，11]。

式中：E為綠原酸吸附率，%；C0為起始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；D為綠原酸解吸率，%；Cd為解吸液中綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為解吸液體積，mL；V0為吸附液體積，mL；R為綠原酸得率，%；P為綠原酸含量，%；m為解吸液干物質(zhì)總質(zhì)量，g；Y為綠原酸產(chǎn)率，%；M為菝葜干粉質(zhì)量，g。

1.3.3 樹脂預(yù)處理及再生

用95%乙醇浸泡6種待處理的大孔樹脂24 h，使其充分膨脹后，用去離子水洗去乙醇；用5%鹽酸溶液浸泡12 h，用去離子水洗至中性（pH試紙檢測），用5%氫氧化鈉溶液浸透12 h，用去離子水沖洗至中性，待用[11]。

1.3.4 拔葜綠原酸粗提液的制備

用粉碎機(jī)將菝葜粉碎，過0.250 mm（60目）篩，待用。

稱取20 g的菝葜粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液搖勻，使粉末浸濕后，按照超聲時間35 min、超聲功率135 W進(jìn)行超聲提取，過濾，提取2次，合并濾液[12]，減壓蒸餾濃縮至無醇味（酒精計測量乙醇體積分?jǐn)?shù)約2%），離心分離（3 000 r/min，離心5 min），合并上清液即為菝葜粗提液。

1.3.5 大孔樹脂D101吸附除雜

將菝葜粗提液和D101大孔樹脂（比例為50∶1 mL/g）放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩24 h。將振蕩后的溶液進(jìn)行過濾，濾液即為大孔樹脂D101除雜后溶液，測定其中綠原酸含量，備用。

1.3.6 大孔樹脂提純菝葜中綠原酸的單因素試驗

以大孔樹脂D101除雜后溶液為原料液，以樹脂提純后樣品中綠原酸的含量和得率為指標(biāo)，研究樹脂種類、吸附液pH、吸附液濃度、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對大孔樹脂提純菝葜綠原酸的影響[4]。

1.3.6.1 樹脂種類對提純工藝的影響

將原料液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2，在5個250 mL的錐形瓶中各放入150 mL，放入已經(jīng)處理好的NKA-II、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5樹脂各3 g，放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩24 h。取出后抽濾，測定吸附液中未吸附的綠原酸的含量。將抽濾后的樹脂用適量的pH 3的酸水沖洗、抽濾干后，放入原錐形瓶中，分別加入50 mL 40%的乙醇，放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩解吸24 h。用HPLC法測定過濾后解吸液中綠原酸含量；將解吸出的溶液蒸干，測定干物質(zhì)質(zhì)量，計算不同樹脂種類下綠原酸的含量和得率。

1.3.6.2 吸附液pH對提純工藝的影響

將吸附液pH調(diào)至1，2，3，4和5后，其他條件不變，參照1.6.3.1進(jìn)行吸附解吸試驗，研究吸附液pH對提純工藝的影響。

1.3.6.3 吸附液質(zhì)量濃度對提純工藝的影響

將吸附液質(zhì)量濃度調(diào)至0.04，0.08，0.12，0.16和0.20 mg/mL，其他條件不變，參照1.6.3.1進(jìn)行吸附解吸試驗，研究吸附液質(zhì)量濃度對提純工藝的影響。

1.3.6.4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對提純工藝的影響

將解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)調(diào)至20%，30%，40%，50%和60%，其他條件不變，參照1.6.3.1進(jìn)行吸附解吸試驗，研究解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對提純工藝的影響。

1.3.7 大孔樹脂提純菝葜中綠原酸的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以綠原酸含量和得率為指標(biāo)，選擇A（樹脂種類）、B（吸附液pH）、C（解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)）、D（吸附液質(zhì)量濃度）4個因素，設(shè)計L9(34)正交試驗。

1.3.8 大孔樹脂動態(tài)提純菝葜中的綠原酸

1.3.8.1 上柱樣體積和流速的測定

將最優(yōu)樹脂放入3支1.2 cm×40 cm的玻璃層析柱中，高度15 cm左右，將經(jīng)過D101樹脂除雜后的原料液按照正交試驗確定的以綠原酸含量為指標(biāo)確定的最佳靜態(tài)吸附工藝條件進(jìn)行動態(tài)吸附試驗。分別控制流速1，2和3 BV/h，每柱體積收集1次，并進(jìn)行液相色譜檢測，在流出液綠原酸的質(zhì)量濃度為上樣液綠原酸質(zhì)量濃度的l/10時即達(dá)到泄漏點[13]，認(rèn)為綠原酸透過，停止上樣。確定上樣液體積及流速。

1.3.8.2 解吸液體積對解吸效果的影響

將吸附綠原酸達(dá)到泄漏點的樹脂，按照正交試驗得出的最優(yōu)解吸條件進(jìn)行解吸。前2 BV解吸液收集在一起，后每隔1 BV收集1次，分別取樣，進(jìn)行HPLC檢測，測定解吸液中綠原酸含量，確定最優(yōu)解吸液體積。

1.3.8.3 綠原酸含量和產(chǎn)率的計算

取120.000 0 g菝葜干粉，按照最優(yōu)工藝提純，按照式1.3.2中公式（4）計算純化過程的綠原酸含量變化，按照公式（5）計算純化后綠原酸產(chǎn)率。

1.3.9 大孔樹脂NKA-Ⅱ的重復(fù)使用次數(shù)試驗

將工藝用量較大的NKA-Ⅱ樹脂使用后按照1.3.3再生后重復(fù)使用。

將再生好的NKA-Ⅱ樹脂放入1.2 cm×40 cm的玻璃層析柱中，高度15 cm，將經(jīng)過D101樹脂除雜后的原料液按照最優(yōu)工藝進(jìn)行吸附試驗。當(dāng)吸附率降至新樹脂對綠原酸吸附率的70%[14]時，停止再生，記錄樹脂的重復(fù)使用次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=31 508.29x+285.49，R2=0.995。其中：y為綠原酸色譜峰面積，mAU；x為綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL。結(jié)果表明綠原酸在0.01～ 0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 樹脂種類對綠原酸提純效果的影響

由表2可知：極性樹脂純化效果好于弱極性樹脂和非極性樹脂，這是因為綠原酸是有一定極性的有機(jī)酸，更容易被極性樹脂吸附[15]。NKA-II樹脂純化后得率和含量最高，因此選擇NKA-II樹脂作為最優(yōu)樹脂，進(jìn)行后續(xù)單因素試驗，NKA-II、NKA-9和HPD400樹脂為正交試驗中樹脂種類的3個水平。

表2 樹脂種類對綠原酸提純效果的影響

2.2.2 吸附液pH對綠原酸提純效果的影響

由圖1可知：pH 2時，純化后綠原酸含量最高，這是因為綠原酸是有機(jī)酸，酸性環(huán)境下綠原酸以分子形式存在，有利于樹脂對綠原酸分子的吸附[6]。弱酸性環(huán)境也有利于黃酮類等其他物質(zhì)的吸附[13]，因此pH 4時，綠原酸得率雖然最高，但是綠原酸含量卻不是最高?？紤]到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，以純化后綠原酸含量最高的pH 2作為單因素試驗的最優(yōu)pH，選擇pH 1，2和3作為正交試驗中吸附液pH的3個水平。

圖1 吸附液pH對綠原酸提純效果的影響

2.2.3 吸附液質(zhì)量濃度對綠原酸提純效果的影響

由圖2可知：吸附液質(zhì)量濃度越小，綠原酸得率越大，隨著吸附液質(zhì)量濃度上升，綠原酸含量先增大后減小?？紤]到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，選擇0.08 mg/mL為吸附菝葜綠原酸的吸附液質(zhì)量濃度，開展后續(xù)單因素試驗；選擇吸附液質(zhì)量濃度0.04，0.08和0.12 mg/mL為正交試驗中吸附液質(zhì)量濃度的3個水平。

圖2 吸附液質(zhì)量濃度對綠原酸提純效果的影響

2.2.4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提純效果的影響

由圖3可知，隨著解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，綠原酸得率逐漸增大，而綠原酸含量先增大后減小。因為與水相比，綠原酸在乙醇中的溶解度更大。由相似相容原理，較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸的解吸更有利；但較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)也有利于黃酮類物質(zhì)等其他醇溶性成分的解吸[11，13]。考慮到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，選擇50%作為最優(yōu)解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)，選擇40%，50%和60%為正交試驗中解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個水平。

圖3 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提純效果的影響

2.3 正交試驗

由表3可知，以菝葜綠原酸含量為指標(biāo)，各因素影響的大小依次為樹脂種類＞吸附液pH＞解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)＞吸附液質(zhì)量濃度。其中，樹脂種類顯著影響。最佳組合為A1B1C1D2，即大孔樹脂采用NKA-Ⅱ、吸附液pH 1、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、吸附液質(zhì)量濃度0.08 mg/mL。

由表3可知：以菝葜綠原酸得率為指標(biāo)，各因素影響的大小依次為解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)＞樹脂種類＞吸附液質(zhì)量濃度＞吸附液pH；其中，解吸液乙醇濃度顯著影響；最佳組合為A1B3C3D3，即大孔樹脂采用NKA-Ⅱ、pH 3、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、吸附液濃度0.04 mg/mL。

表3 正交試驗因素水平及結(jié)果

為驗證正交試驗中獲得最優(yōu)的組穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，在最優(yōu)組合下，各進(jìn)行3次平行試驗。即以綠原酸含量為指標(biāo)，含量的平均值為6.4%，得率平均值為52.3%。以綠原酸得率為指標(biāo)，含量的平均值為5.0%，得率的平均值為63.9%。

2.4 動態(tài)試驗分離純化菝葜中的綠原酸

2.4.1 泄漏點的測定及流速對樹脂吸附的影響

大孔樹脂提純天然產(chǎn)物時，一般較低的流速有利于吸附[13]，然而流速過低，完成吸附的時間就要延長，降低提純效率。圖4為不同流動速度下，流出液中綠原酸質(zhì)量濃度的變化圖。流速1 BV/h時，10 BV達(dá)到綠原酸泄漏點，流速2 BV/h時，8 BV達(dá)泄漏點，雖然完成1周期吸附，少處理2 BV樣品液，但吸附速度提高1倍。因此，綜合考慮處理量和吸附速度，2 BV/h為最佳上樣液流速，在此流速下，上樣液體積為8 BV。

圖4 上樣液流速對樹脂吸附的影響

2.4.2 解吸液體積對解吸效果的影響

由圖5可知，解吸液體積為前2 BV時，流出液主要為雜質(zhì)，綠原酸含量很小，不收集。當(dāng)解吸液體積達(dá)到5 BV時，大部分綠原酸被解吸下來，繼續(xù)增加解吸體積可能將樹脂吸附的部分雜質(zhì)解吸出來，影響純化效果。因此，解吸液體積控制在5 BV，收集第3～第5 BV解吸液。

圖5 解吸液體積對解吸效果的影響

2.5 菝葜綠原酸含量和產(chǎn)率

2.5.1 菝葜綠原酸含量（見表4）

表4 純化過程中綠原酸含量的變化

2.5.2 菝葜綠原酸的產(chǎn)率（見表5）

表5 菝葜綠原酸的產(chǎn)率

2.6 樹脂NKA-Ⅱ的重復(fù)使用次數(shù)

由表6可知，由于一些強(qiáng)吸附性雜質(zhì)的影響，樹脂第8次再生后，對綠原酸的吸附率將至59.3%，低于61.3%（即新樹脂吸附率的70%），認(rèn)為不能繼續(xù)使用。因此，經(jīng)過再生，NKA-Ⅱ樹脂共可以使用8次，8次后需要更換新樹脂。

表6 樹脂再生后使用次數(shù)對綠原酸吸附率的影響

3 結(jié)論

以菝葜為原料，利用超聲波粗提，經(jīng)大孔樹脂D101除雜，NKA-Ⅱ樹脂提純的工藝，可有效提純菝葜中綠原酸。提純后，菝葜綠原酸含量顯著提高。樹脂NKA-Ⅱ再生處理后，共計可使用8次。試驗可為菝葜中綠原酸的工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。