張品，朱文秀，余順波，陳大倫，李風(fēng)華，郭晉紅

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所（貴陽 550018）

紫蘇（Perilla frutescens）作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物資源，越來越受到人們的重視，近年來其開發(fā)利用已成為研究熱點(diǎn)[1-6]。紫蘇餅粕是紫蘇籽油加工過程中的副產(chǎn)物，其氣味芬芳，適口性好，蛋白質(zhì)含量20%～25%，含18種氨基酸且富含人體所必需的8種氨基酸[7-14]，是一種優(yōu)良的植物蛋白資源。目前，紫蘇餅粕主要是作為飼料或肥料還田，在一定程度上污染環(huán)境，造成優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的浪費(fèi)[15-18]。隨著紫蘇的大面積種植和紫蘇籽油的開發(fā)利用，如何有效、充分、合理利用優(yōu)質(zhì)紫蘇餅粕，研究開發(fā)蛋白產(chǎn)品成為目前亟待解決的問題。堿溶酸沉法是利用蛋白質(zhì)在堿液中溶解、等電點(diǎn)沉淀的這一特性，該方法提取條件溫和，蛋白質(zhì)不易變質(zhì)，工藝流程簡單，生產(chǎn)成本低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用[19-20]。試驗(yàn)以脫脂紫蘇餅粕為原料，采取堿溶酸沉法提取紫蘇餅粕蛋白。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件，以期為紫蘇蛋白資源的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇餅粕（貴州油研純香生態(tài)糧油科技有限公司）；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；石油醚（沸程30～60 ℃）；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸（均為分析純，阿拉?。?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-2l冷凍水浴全溫?fù)u床（常州市瑞華儀器制造有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；L-550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇餅粕蛋白提取工藝流程

紫蘇餅粕→脫脂→加水→調(diào)節(jié)pH→加熱提取→離心→收集上清液→調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)→離心→收集沉淀物→真空低溫干燥→粉碎，過篩→粗提紫蘇餅粕蛋白

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1 基本組成成分的測定

水分，采用GB/T 10358—2008[21]的恒重法測定；粗脂肪，采用GB/T 6433—2006[22]的索氏抽提法測定；粗蛋白，采用GB 5009.5—2016[23]的凱氏定氮法測定；灰分，采用GB 5009.4—2016[24]的灼燒重量法測定；可溶性蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定。

1.3.2.2 紫蘇餅粕蛋白等電點(diǎn)的測定

紫蘇餅粕蛋白等電點(diǎn)的測定采用溶解性法。用10%氫氧化鈉溶液和15%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH，在pH 3.0～ 5.6范圍內(nèi)設(shè)14個(gè)點(diǎn)，確定紫蘇餅粕蛋白的等電點(diǎn)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以蛋白提取率為指標(biāo)，考察餅粕顆粒大小、料液比、堿提pH、堿提溫度、堿提時(shí)間和攪拌速度對(duì)蛋白提取率的影響。采用Bradford法測定堿提離心后上清液中蛋白質(zhì)濃度，提取率按式（1）計(jì)算。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以蛋白提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律，各因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平及編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作。采用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性分析。使用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，使用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本組成成分分析

紫蘇餅粕和脫脂紫蘇餅粕的基本組成成分如表2所示（蛋白質(zhì)系數(shù)以6.25計(jì)）。從表2可以看出，紫蘇餅粕的粗蛋白含量30.33%，脫脂后含量更高，達(dá)36.68%，是分離提取蛋白質(zhì)的良好植物蛋白資源。

表2 紫蘇籽、紫蘇餅粕和脫脂紫蘇餅粕基本組成成分表 單位：%

2.2 紫蘇餅粕蛋白等電點(diǎn)的測定

pH與鹽酸調(diào)節(jié)后上清液蛋白質(zhì)濃度關(guān)系如圖1所示。上清液中蛋白質(zhì)的濃度隨著pH增加先降低后增加。在pH 4.2～4.6，上清液中蛋白質(zhì)濃度較低；pH 4.4時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)濃度最低，只有203.753 3 μg/mL，說明pH 4.4時(shí)溶液中的大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀，紫蘇餅粕蛋白的溶解度最小，基于此判斷紫蘇餅粕蛋白的等電點(diǎn)（PI）在4.4左右，這與朱國君[20]報(bào)道結(jié)果吻合。試驗(yàn)選擇pH 4.4作為紫蘇餅粕蛋白分離提取工藝酸沉淀的最適pH。

圖1 紫蘇餅粕蛋白等電點(diǎn)的測定結(jié)果

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 餅粕顆粒大小對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

餅粕顆粒越小，越有利于堿提液穿透餅粕接觸到蛋白分子，越有利于蛋白的溶出。由圖2可見，顆粒大小對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響并不明顯。顆粒大小＞0.25 mm，蛋白提取率為16.68%；隨著顆粒大小的降低，蛋白提取率提高不顯著。故試驗(yàn)選取顆粒大?。?.25 mm的脫脂紫蘇餅粕為原料。

圖2 餅粕顆粒大小對(duì)蛋白提取率的影響

2.3.2 料液比對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

不同料液比對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響見圖3。提取液的多少對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率有顯著的影響，是由于堿提過程中料液比的多少，會(huì)影響蛋白在提取液中的溶解。料液比從1∶5（g/mL）增加至1∶20（g/mL），蛋白提取率從13.77%提高到28.95%；料液比從1∶20（g/mL）增加至1∶25（g/mL），蛋白提取率從28.95%提高到30.57%，增幅有所下降；料液比從1∶25（g/mL）增加至1∶30（g/mL），蛋白提取率從30.57%提高到31.33%，無顯著差異。因此選取料液比1∶25（g/mL）進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白的提取優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

2.3.3 堿提pH對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

試驗(yàn)選取堿提pH 6～11考察其對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響。由圖4可以看出，紫蘇餅粕蛋白提取率隨堿提pH變化而發(fā)生顯著變化，是因?yàn)閴A提pH的變化能夠改變蛋白質(zhì)的帶電情況，直接影響到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-水的相互作用，使蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生明顯變化。pH 6時(shí)，堿提液接近中性，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的作用較強(qiáng)，蛋白提取率比較低，只有5.87%；隨著pH增加，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用減弱，蛋白質(zhì)-水之間的作用增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白提取率增加。達(dá)到pH 9后，蛋白提取率的升高趨勢變緩慢。強(qiáng)堿性可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的變性從而使其喪失利用價(jià)值，故選取堿提pH 8～10進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白的提取優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 堿提pH對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

2.3.4 堿提溫度對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在不同的溫度下溶解度不同，試驗(yàn)選取堿提溫度30～70 ℃考察其對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響。由圖5可以看出，隨著堿提溫度改變，紫蘇餅粕蛋白提取率變化顯著。溫度從30 ℃升高至60 ℃，蛋白提取率從13.73%提高到20.46%，溫度越高，蛋白質(zhì)的溶解度越高，蛋白提取率越高。溫度升高至70 ℃，蛋白提取率略有降低，可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致的淀粉糊化、蛋白質(zhì)變性等影響蛋白質(zhì)的溶解度，進(jìn)而影響蛋白提取率。故選取堿提溫度40～60 ℃進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白的提取優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 堿提溫度對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

2.3.5 堿提時(shí)間對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

試驗(yàn)選取堿提時(shí)間30～150 min考察其對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響。由圖6可以看出，隨著堿提時(shí)間的延長，紫蘇餅粕蛋白提取率隨之增加。堿提時(shí)間從30 min延長至120 min，蛋白提取率從13.07%提高到26.22%；堿提時(shí)間超過120 min后蛋白提取率提高不明顯。這可能是由于堿提液需要一定的時(shí)間穿透餅粕顆粒，使蛋白質(zhì)逐步水化與溶解；到達(dá)一定堿提時(shí)間后，所有蛋白質(zhì)基本水化溶出，提取率變化緩慢，甚至沒有變化。因此選取堿提時(shí)間60～120 min進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白的提取優(yōu)化試驗(yàn)。

圖6 堿提時(shí)間對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

2.3.6 攪拌速度對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

攪拌速度對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響如圖7所示。攪拌速度從50 r/min增加至150 r/min，蛋白提取率從15.38%提高到20.82%；攪拌速度超過150 r/min后蛋白提取率基本保持不變。提取過程中攪拌可以幫助堿提液更快地穿透餅粕顆粒接觸到蛋白分子。但是當(dāng)攪拌速度達(dá)到一定程度后，蛋白溶出達(dá)到平衡，蛋白提取率保持不變。因此選取攪拌速度150 r/min進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白的提取優(yōu)化試驗(yàn)。

圖7 攪拌速度對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗(yàn)分析，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)三因子三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值的三元二次回歸模型方程：蛋白提取率（Y）=26.658+1.763 75A+ 2.831 25B+1.575C-1.722 5AB-2.05AC-1.215BC- 5.240 25A2-3.470 25B2-0.132 25C2。

回歸模型方差分析見表4。由表4可知，所建立的蛋白提取率回歸模型F值為33.54，p值小于0.000 1，表明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)非常吻合。R2=0.977 3，表明只有2.27%的變異不能被模型解釋，說明模型能夠較好反映響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)F值為1.74，p值為0.297 6不顯著，說明回歸模型和預(yù)測值之間有較好擬合度。變異系數(shù)較低（4.54%），表明所做的試驗(yàn)具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。模型的一次項(xiàng)A、B、C（p＜ 0.01）影響均極顯著；二次項(xiàng)A2、B2（p＜0.01）影響極顯著，C2（p＞0.05）影響不顯著；交互項(xiàng)AC（p＜ 0.01）影響極顯著，AB、BC（p＜0.05）影響顯著；由A、B、C的F值可知3個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響的順序?yàn)锽＞A＞C，即堿提溫度＞堿提pH＞堿提時(shí)間。

2.4.2 響應(yīng)面交互分析

為直觀反映各因素及其交互作用對(duì)蛋白提取率的影響結(jié)果，對(duì)回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖，見圖8。堿提pH與堿提溫度交互曲面陡峭，表明二者對(duì)蛋白提取率的交互作用明顯，堿提時(shí)間與堿提pH、堿提溫度交互曲面比較平緩，表明二者對(duì)蛋白提取率交互作用不明顯。

圖8 各因素交互作用對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面曲線圖

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以蛋白提取率為指標(biāo)，由響應(yīng)面軟件優(yōu)化的紫蘇餅粕蛋白提取工藝條件為堿提pH 8.932，堿提溫度52.5 ℃，堿提時(shí)間120 min。該條件下蛋白提取率為28.576 9%。綜合考慮，調(diào)整提取工藝參數(shù)為堿提pH 8.9，堿提溫度53 ℃，堿提時(shí)間120 min。采取該最佳條件進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白提取，所得的提取率為29.765 2%，與理論值無顯著差異，表明可利用此模型對(duì)紫蘇餅粕蛋白提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.5 產(chǎn)品指標(biāo)

按照試驗(yàn)所得工藝條件對(duì)紫蘇餅粕進(jìn)行堿溶酸沉，離心，低溫干燥后所得紫蘇餅粕蛋白產(chǎn)品呈淡黃色，帶有紫蘇特有的香氣；其水分5.26%、灰分2.93%、粗脂肪0.68%、粗蛋白（蛋白純度）85.36%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)確定紫蘇餅粕蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)：餅粕顆粒大?。?.25 mm，料液比1∶25（g/mL），堿提pH 8.9，堿提溫度53 ℃，堿提時(shí)間120 min，攪拌速度150 r/min。在此最優(yōu)工藝參數(shù)下蛋白提取率為29.765 2%，蛋白純度為85.36%，產(chǎn)品具有紫蘇獨(dú)特的清香。