許盧春 王建軍 李華南

摘要 目的：探討桃紅四物湯治療腰椎間盤突出癥的作用機制。方法：借助中藥整合藥理學平臺，結合中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)，按照“中藥-成分-靶標-通路”關聯(lián)性研究，探討其治療腰椎間盤突出的作用機制。結果：共得到桃紅四物湯有效成分69個和腰椎間盤突出癥的相關靶點396個，進行映射得到48個共同靶點。進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡及其拓撲分析后得到含有203個節(jié)點的PPI網(wǎng)絡，可能是桃紅四物湯治療LDH的重要靶點。進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析得到各排名前20的生物過程、分子功能、細胞組分和KEGG信號通路，生物過程涉及對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應等;分子功能涉及絲氨酸水解酶活性、細胞因子受體結合等;細胞組分涉及膜筏、膜微區(qū)等;KEGG信號通路涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17等。結論：桃紅四物湯通過多種通路對腰椎間盤突出癥產生治療作用，生物學機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17等有關。

關鍵詞 網(wǎng)絡藥理學;桃紅四物湯;中藥;腰椎間盤突出癥;靶點;基因;信號通路;作用機制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of lumbar intervertebral disc herniation.Methods：With the aid of the integrated pharmacology platform of Chinese medicinals，combined with the big data of traditional Chinese medicine，according to the correlation study of “Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target-Pathway”，the mechanism of its treatment of lumbar disc herniation was discussed.Results：A total of 69 effective components of Taohong Siwu Decoction and 396 related targets of lumbar disc herniation were obtained，and 48 common targets were obtained by mapping.After analyzing the protein interaction network and its topology，a protein interaction network with 203 nodes was obtained，which may be an important target of Taohong Siwu Decoction in the treatment of LDH.After the GO and KEGG pathway enrichment analysis，the top 20 biological processes，molecular functions，cell composition and KEGG signaling pathways are obtained.The biological process involved the reaction to lipopolysaccharide and the reaction to the molecules of bacterial origin; molecular functions involve serine hydrolase activity，cytokine receptor binding，etc.; cell composition involves membrane rafts，membrane microdomains，etc.; KEGG signaling pathway involves AGE-RAGE，TNF，IL-17 etc.Conclusion：Taohong Siwu Decoction has a therapeutic effect on lumbar intervertebral disc herniation through a variety of pathways.The biological mechanism may be related to AGE-RAGE，TNF，IL-17，etc.

Keywords Network pharmacology; Taohong Siwu Decoction; Traditional Chinese medicine; Lumbar disc herniation; Targets; Genes; Signaling pathway; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.007

腰椎間盤突出癥（Lumbar Disc Herniation，LDH）是腰腿痛最常見原因之一，也是常見的缺勤、就診、住院和手術原因[1]。文獻報道該病國內發(fā)病率為18%，青少年的發(fā)病率為1%～5%，但如今LDH發(fā)病率開始逐年穩(wěn)固上升且越趨于年輕化[2-4]。手術治療LDH具有創(chuàng)傷且可能會產生一系列的并發(fā)癥，患者往往不易于接受。保守療法創(chuàng)傷小，患者普遍易于接受，是目前臨床上LDH的首選治療方法，80%～90%的LDH患者的病情可隨保守治療時間延長有所改善甚至痊愈[5-6]。西醫(yī)治療LDH以抗炎鎮(zhèn)痛、促進淋巴回流、營養(yǎng)神經等藥物，牽引和理療為主。中醫(yī)治療以中藥內服、外用，針灸，推拿等方法為主，治療效果明顯且不良反應少，是大多數(shù)LDH患者選擇的治療方式之一[7]。

LDH在中醫(yī)學中屬于“骨錯縫”“筋出槽”“腰痛”“腰痹”等疾病范疇，多由于外傷、勞損而致經絡受損從而導致氣滯血瘀、經絡受阻，因此一般使用理氣通絡、活血化瘀的治法進行治療[8-10]。桃紅四物湯始于清代《醫(yī)宗金鑒》，以活血養(yǎng)血為主要功效，桃仁、紅花使瘀血祛，熟地黃、當歸、芍藥使新血生，川芎使氣機暢，全方以活血化瘀為核心，療效確切，但是治療機制尚不明確[11-14]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學進行分析，為本病的臨床和基礎研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯活性成分的挖掘與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫中對桃紅四物湯中的桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎6味中藥逐一進行檢索，納入口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%并且類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18的活性成分。

1.2 LDH靶點的挖掘

檢索疾病以找到相關靶點，檢索數(shù)據(jù)庫為GeneCards，檢索詞為“Lumbar Disc Herniation”。將在數(shù)據(jù)庫中查找到的數(shù)據(jù)信息進行相應的錄入和整理。

1.3 核心靶點篩選及活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建

利用Venny 2.1在線工具繪制桃紅四物湯有效活性成分和LDH靶點的韋恩圖，得到桃紅四物湯治療LDH的核心靶點。使用Cytoscape 3.8.2構建活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

將交集靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，運用BisoGenet數(shù)據(jù)包進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建。再通過限定計算度中心度（DC）和中間度中心度（BC），篩選PPI網(wǎng)絡中具有拓撲重要性的相關節(jié)點，最后得到核心網(wǎng)絡。

1.5 基因本體與京都基因與基因組百科全書分析

使用R 3.6.1進行基因本體（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。并借助Cytoscape 3.8.2軟件構建網(wǎng)絡圖以說明靶點及信號通路所發(fā)揮的作用。

2 結果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點

對桃紅四物湯中的所有中藥成分進行篩選，篩選條件為OB≥30%和DL≥0.18，共得到桃紅四物湯的69個有效成分。見表1～6。桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎的成分分別為23、22、2、13、2、7個。

2.2 核心靶點篩選及活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建

在GeneCards數(shù)據(jù)庫對LDH進行檢索后找到相關靶點共396個，與桃紅四物湯取交集后，共得48個共同靶點。見圖1，表7。Cytoscape構圖得到了一個包含79個點和136條邊的活性成分-靶點網(wǎng)絡。其中桃仁、紅花、白芍和川芎的活性成分分別為藍色、粉色、綠色和黃色，藥物共有的活性成分為紅色，交集靶點為藍色。前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、半胱天冬蛋白酶3（CASP3），轉錄因子AP-1（JUN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）為Degree值排名前5的靶點，它們的值分別是30、7、6、5、5。見圖2。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建分析

將交集靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，運用BisoGenet數(shù)據(jù)包進行PPI網(wǎng)絡的構建，限定研究物種為人類，進行PPI分析得到網(wǎng)絡圖，此網(wǎng)絡包含了3 359個節(jié)點。見圖3A。通過設置計算度中心度（DC）≥61后創(chuàng)建子網(wǎng)絡，此網(wǎng)絡包含了753個節(jié)點。見圖3B。中間度中心度（BC）≥600子網(wǎng)絡，含有203個節(jié)點，可能是桃紅四物湯治療LDH的重要靶點。見圖3C。

2.4 GO功能富集分析

使用R 3.6.1進行GO富集分析。得出排名靠前的20個生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及細胞組分（Cell Component，CC），BP涉及對脂多糖的反應、對活性氧的反應、對氧化應激的反應及對營養(yǎng)水平的反應等;MF涉及絲氨酸水解酶活性、細胞因子受體結合及細胞因子活性等;CC涉及膜筏、囊泡腔、膜區(qū)及膠原蛋白細胞外基質等。見圖4～6。柱狀圖的長度和紅色的程度代表了富集基因的數(shù)目和富集的顯著程度。

2.5 KEGG信號通路富集分析

使用R 3.6.1軟件和Cytoscape 3.8.2軟件進行KEGG通路富集分析和治療靶點信號通路網(wǎng)絡圖的構建。見圖7。KEGG分析得出靶點主要富集于AGE-RAGE通路、TNF通路、IL-17通路、松弛素通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染等。見圖8。泡泡節(jié)點的大小和紅色的程度代表了富集基因的數(shù)目和富集的顯著程度。

3 討論

LDH最常見的證型為氣滯血瘀型，一般使用理氣通絡、活血化瘀的治法進行治療，治療后氣血調達、痹阻通暢，故可使臨床癥狀有所好轉[11，15-16]。經典活血化瘀名方桃紅四物湯具有活血養(yǎng)血，祛瘀行滯的作用，更適用于治療氣滯血瘀型的LDH，且在降低LDH術后復發(fā)率、抗炎鎮(zhèn)痛方面具有作用[17-21]。

網(wǎng)絡藥理學是探索藥物與疾病之間關系的一種方法，通過“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡將其呈現(xiàn)出來[22]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學這一工具預測桃紅四物湯治療LDH的可能機制。LDH的癥狀主要由于各種原因導致髓核組織突出纖維環(huán)壓迫脊髓、神經根而來，但也還與炎癥介質以及介導的反應相關。髓核突出后引起血管擴張以及通透性增加，伴隨著增加的炎癥介質誘發(fā)各種信號轉導[23-25]。同時椎間盤退變也與髓核含水量、降解的細胞外基質等多個生物學因素相關。所以桃紅四物湯對于LDH的治療機制可能體現(xiàn)在對炎癥的抑制，細胞凋亡的調控，減緩椎間盤的蛻變速度，保護壓迫的神經等方面[26-28]。

本研究借助TCMSP，共得到桃紅四物湯的69個活性成分，其中桃仁的活性成分最多，其次為紅花，說明了桃仁、紅花在本方中的重要作用。在GeneCards數(shù)據(jù)庫對LDH進行檢索后找到相關靶點共396個，與桃紅四物湯取交集后，共得到48個共同靶點。Cytoscape構圖得到了一個包含79個點和136條邊的活性成分-靶點網(wǎng)絡，顯示桃紅四物湯治療LDH的多靶點特性，PTGS2、AR、CASP3、JUN、AKT1為Degree值排名前5的靶點，提示本方的作用機制涉及炎癥反應、激素調控、細胞凋亡等。

PPI網(wǎng)絡說明靶點之間的相互作用調節(jié)可能是桃紅四物湯治療LDH的潛在機制之一。從GO功能富集分析可知，桃紅四物湯治療LDH主要涉及對脂多糖的反應、對活性氧的反應、對氧化應激的反應及對營養(yǎng)水平的反應等生物過程。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯對于LDH的治療機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17信號通路等相關。AGE-RAGE信號通路對下游通路的激活會導致細胞功能紊亂，同時活化IL-6、核因子κB信號通路、半胱天冬蛋白酶3、基質金屬蛋白酶等的表達，促進炎癥介質的表達導致炎癥反應[29-31]。TNF信號通路同樣與炎癥介質相關，腫瘤壞死因子可以對其他通路產生激活效應而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致疼痛的發(fā)生及加劇[32]。IL-17可作用于人內皮細胞、巨噬細胞、軟骨細胞及骨細胞等多種細胞，并可誘導其他炎癥介質如TNF-α、IL-1β、IL-6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等的表達，從而發(fā)揮其致炎作用[33-36]。因此，桃紅四物湯治療LDH的有效性來源可能與對炎癥介質及細胞凋亡的控制相關。

桃紅四物湯治療LDH具有多靶點、多途徑、多通路等特點，其主要生物學機制可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17信號通路等有關。本研究初步闡述了桃紅四物湯治療LDH的潛在靶點和信號通路，為以后臨床實踐提供參考。但由于靶標眾多等因素的干擾以及網(wǎng)絡藥理學的自身局限性[37]，研究結果的偏差需要進一步的分子生物學和生物信息學來進行驗證。

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（2021-01-03收稿 本文編輯：魏慶雙）