黃佳梅，蔡紫璨，張 花,，唐 娜，萬(wàn) 維，金志春,

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2. 華中科技大學(xué)附屬湖北婦幼保健院，湖北 武漢 430070)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧化還原系統(tǒng)失衡，自由基顯著增加到超過(guò)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力。正常人體內(nèi)活性氧物種和抗氧化物酶水平維持著平衡，當(dāng)平衡被打破時(shí)，則活性氧產(chǎn)生過(guò)多，引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，可導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化[1]。卵母細(xì)胞的老化主要表現(xiàn)為卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的逐漸下降，可直接導(dǎo)致女性卵巢儲(chǔ)備功能低下(DOR)，從而出現(xiàn)生殖內(nèi)分泌功能紊亂、生育能力降低[2]。DOR主要病理改變是卵巢中儲(chǔ)備的卵泡較同齡女性顯著減少，可進(jìn)一步發(fā)展為卵巢早衰。目前DOR以激素替代治療為主以維持性激素功能，但長(zhǎng)期激素治療的風(fēng)險(xiǎn)和不良反應(yīng)較多[3-4]，對(duì)有生育要求的女性不能改善生殖功能。 課題組前期臨床研究顯示，補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法可調(diào)節(jié)體外授精-胚胎移植術(shù)患者降調(diào)日、HCG日及取卵日血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，增加卵泡對(duì)外源性促性腺激素的敏感性[5]；動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)及其受體flt-1、kdr蛋白的表達(dá)，促進(jìn)卵巢組織間質(zhì)血管生成，間接改善卵巢儲(chǔ)備功能[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察DOR大鼠血清及卵巢組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物的變化，進(jìn)一步探究了補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)成熟雌性SD大鼠60只，體重200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心使用許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2016-0057。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫24～25 ℃，濕度50%～60%，光照周期12/12 h，自由攝食飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華中科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(S2699)。

1.2藥物 注射用環(huán)磷酰胺(安道生，德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司，規(guī)格：0.2 g×1支，批號(hào)：1A445A)；戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè)，拜爾醫(yī)藥保健有限公司，每片含戊酸雌二醇1 mg，批號(hào)：626A)。補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法中藥復(fù)方：按組方比例稱取菟絲子105 g、補(bǔ)骨脂70 g、枸杞子105 g、熟地黃105 g、山茱萸105g、山藥105g、當(dāng)歸70g、川芎70g、白芍70 g、香附70 g、黨參105 g、黃芪105 g、白術(shù)105 g，飲片由湖北省婦幼保健院中藥房提供。取總藥材2倍量雙蒸水浸泡藥材20 min后，武火煎煮，沸后文火再煎20 min；再加2倍量雙蒸水，武火沸后文火再煎20 min；將2次中藥湯劑均勻混合，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥濃度1 g/mL，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩⒄铡叭撕蛣?dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”換算給藥劑量。

1.3試劑 卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號(hào)分別為E-EL-R0391c、E-EL-R0026c);E2、抗苗勒管激素(AMH)檢測(cè)試劑盒(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司，貨號(hào)分別為06656021190，06331076190);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC) 測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A003-1，A001-3，A006-2-1，A015-3-1)；兔血紅素氧合酶1(HO-1)抗體、鼠醌氧化還原酶1(NQO-1)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為10701-1-AP，67240-1-lg)；DAKO免疫組化試劑盒(貨號(hào)為KG500705)；大鼠HO-1內(nèi)參引物、NQO-1內(nèi)參引物(武漢恒意賽生物科技有限公司，貨號(hào)分別為017000，012580)，NucleoZOL試劑(德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司，貨號(hào)為 740406.50)，Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit試劑盒(美國(guó)New England Biolabs公司,#E3005S)。

1.4主要儀器 酷貝i200電子秤；DM4000生物顯微鏡(德國(guó)Leika)；iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、Access全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)Beckman couiter公司)；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、MP4小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床QBQ-206(其林貝爾公司)、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)BG-gdsAUTO 710 MINI(上海Baygene生物技術(shù)有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermofisher公司)、超微量分光光度計(jì)P100+(美國(guó)Pultton公司)、CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermofisher公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束次日起，每日檢查實(shí)驗(yàn)大鼠陰道脫落細(xì)胞，觀察動(dòng)情周期變化情況。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、環(huán)磷酰胺組、戊酸雌二醇組及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方低、中、高劑量組，每組10只。參照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，空白組大鼠給予生理鹽水腹腔注射，其余各組大鼠給予75 mg/kg環(huán)磷酰胺單次腹腔注射建立DOR模型。次日，戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇0.105 mg/kg灌胃，補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方低、中、高劑量組分別給予補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方8.075 g/kg、16.15 g/kg、32.3 g/kg灌胃，空白組和環(huán)磷酰胺組給予等量去離子水灌胃，均每日1次，連續(xù)21 d。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1大鼠一般情況及動(dòng)情周期 自實(shí)驗(yàn)開始后每日觀察各組大鼠一般情況，包括飲食攝水量、皮毛色澤、精神狀態(tài)、二便情況、體重，同時(shí)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察動(dòng)情周期變化。

1.6.2血清FSH、LH、E2、AMH、MDA、SOD、GSH、T-AOC水平 灌胃結(jié)束后次日，麻醉各組大鼠并心尖取血，分離血清。采用ELISA法檢測(cè)FSH、LH水平，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)E2、AMH水平，采用TBA法檢測(cè)MDA水平，采用WST-1法檢測(cè)SOD水平，采用微板法檢測(cè)GSH水平，采用FRPA法檢測(cè)T-AOC水平。

1.6.3卵巢病理形態(tài) 取血后取出一側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛中固定，48 h后進(jìn)行組織浸蠟脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織學(xué)變化。

1.6.4卵巢組織中HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)情況①Western blot法檢測(cè)：取出干冰速凍的部分卵巢組織，RIPA裂解并提取卵巢組織總蛋白，按照蛋白定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白含量測(cè)定，加5X Laemmli混勻-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ允螃?actin為內(nèi)參，進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、發(fā)光，使用Image J軟件測(cè)定圖像平均灰度值。②免疫組化法檢測(cè)：取4%多聚甲醛固定的部分卵巢組織進(jìn)行浸蠟脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、修復(fù)，冷卻至室溫，按照兩步法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，一抗HO-1(1∶200)、NQO-1(1∶2 500)室溫40 min。DAB顯色，中止后蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.6.5卵巢組織中HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)情況 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)：取出干冰速凍的部分卵巢組織，NucleoZOL裂解并提取卵巢組織中總RNA，測(cè)定RNA樣品濃度，設(shè)計(jì)目的基因?qū)?yīng)引物，HO-1、NQO-1引物序列見(jiàn)表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，按照Luna Universal One-Step RT-qPCR Kitsihe試劑盒說(shuō)明書操作。結(jié)果使用Bio-Rad CFX Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析并計(jì)算樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重變化情況 適應(yīng)性喂養(yǎng)期間各組大鼠體重同步增加；造模后7 d內(nèi)，環(huán)磷酰胺組、補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方高劑量組大鼠體重增加較其余組緩慢；造模后14 d內(nèi)，各組大鼠體重均逐漸增加；造模后21 d內(nèi)，各組大鼠體重增加速度趨于同步。見(jiàn)圖1。

1～7 d為適應(yīng)性喂養(yǎng)期間；7～28 d為造模后灌胃期間圖1 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)期間和造模后灌胃期間體重變化

2.2各組大鼠動(dòng)情周期變化情況 適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，大鼠陰道涂片可見(jiàn)動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期規(guī)律的周期性改變。造模后，除空白組大鼠動(dòng)情周期基本穩(wěn)定外，其余各組大鼠動(dòng)情周期逐漸出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)為周期停滯、延長(zhǎng)或無(wú)明顯周期性變化。灌胃結(jié)束，環(huán)磷酰胺組大鼠均存在動(dòng)情周期紊亂，戊酸雌二醇組3只(30%)、補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方低劑量組4只(40%)、補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中劑量組2只(20%)、補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方高劑量組2只(20%)存在動(dòng)情周期紊亂。

2.3各組大鼠血清性激素水平 與空白組比較，環(huán)磷酰胺組血清FSH、LH水平均明顯升高(P均<0.05)，血清AMH水平明顯降低(P<0.05)，血清E2水平變化不明顯(P>0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，戊酸雌二醇組及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中劑量組血清FSH水平和各藥物組血清LH水平均明顯降低(P均<0.05)，戊酸雌二醇組及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中劑量組血清E2水平均明顯升高(P均<0.05)，各藥物組血清AMH水平變化不明顯(P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠血清FSH、LH、AMH、E2水平

2.4各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 與空白組比較，環(huán)磷酰胺組血清MDA水平明顯升高(P<0.05)，血清SOD、T-AOC水平均明顯降低(P均<0.05)，血清GSH水平變化不明顯(P>0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，戊酸雌二醇組及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方各組血清MDA水平均明顯降低(P均<0.05)，血清SOD、T-AOC水平均明顯升高(P均<0.05)，且戊酸雌二醇組及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中劑量組血清GSH水平均明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

2.5各組大鼠卵巢組織病理形態(tài) 空白組大鼠卵巢組織中見(jiàn)各級(jí)卵泡均勻生長(zhǎng)(包括初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、發(fā)育卵泡)；環(huán)磷酰胺組大鼠卵巢皮質(zhì)處生長(zhǎng)卵泡較少，以初級(jí)卵泡為主，且部分卵泡內(nèi)僅1～2層顆粒細(xì)胞環(huán)繞，閉鎖卵泡增多(卵泡內(nèi)環(huán)繞的顆粒細(xì)胞層次不清晰或減少，透明帶皺縮、卵泡壁塌陷)；各藥物組卵巢皮質(zhì)生長(zhǎng)卵泡數(shù)量較環(huán)磷酰胺組明顯增多，閉鎖卵泡減少，且黃體組織體積增大。見(jiàn)圖4。

深色箭頭指示為生長(zhǎng)卵泡；淺色箭頭指示為閉鎖卵泡圖4 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠卵巢組織形態(tài)(HE染色，×100)

2.6各組大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)情況 環(huán)磷酰胺組HO-1、NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05)，戊酸雌二醇組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于環(huán)磷酰胺組(P均<0.05)，補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方高劑量組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量和補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方低劑量組NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于環(huán)磷酰胺組和戊酸雌二醇組(P均<0.05)，見(jiàn)圖5。免疫組化檢測(cè)顯示HO-1、NQO-1主要表達(dá)在卵母細(xì)胞、卵泡液、顆粒細(xì)胞中，其中在卵母細(xì)胞、卵泡液中呈強(qiáng)表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞中呈弱表達(dá)，且與NQO-1蛋白相比，HO-1蛋白在卵巢組織中表達(dá)更強(qiáng)，各組間HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與Western blot法檢測(cè)基本一致，見(jiàn)圖6及圖7。

圖5 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)情況

圖6 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠卵巢組織中HO-1蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×200)

圖7 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠卵巢組織中NQO-1蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×200)

2.7各組大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)情況 環(huán)磷酰胺組HO-1、NQO-1mRNA相對(duì)表達(dá)量均較空白組低，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中、高劑量組HO-1mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于環(huán)磷酰胺組(P均<0.05)；各藥物組NQO-1mRNA相對(duì)表達(dá)量均較環(huán)磷酰胺組高，但組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 空白組和卵巢儲(chǔ)備功能低下各組大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)情況

3 討 論

DOR發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前普遍認(rèn)為其與顆粒細(xì)胞過(guò)度凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖有關(guān)[8]。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞關(guān)系密切，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)分化因子(GDF-9)可通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞凋亡，防止卵泡閉鎖，促進(jìn)卵泡的生存和增殖；當(dāng)GDF-9表達(dá)下調(diào)時(shí)，可以激活Caspase-3，引起顆粒細(xì)胞凋亡, 最終觸發(fā)卵泡閉鎖[9]。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞凋亡，在卵泡促凋亡信號(hào)出現(xiàn)之前就可以檢測(cè)到活性氧水平顯著上升[2，10]。環(huán)磷酰胺是一種烷基化化療藥物，對(duì)成年雌性大鼠單次大劑量注射環(huán)磷酰胺24 h后，可造成卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和次級(jí)卵泡、有腔卵泡的破壞[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用4-氫過(guò)氧化環(huán)磷酰胺(4HC)快速處理過(guò)的COV434細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭，活性氧水平迅速升高，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，提示活性氧可介導(dǎo)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡[12]。MDA、SOD、GSH、T-AOC、HO-1、NQO-1因子是參與機(jī)體氧化應(yīng)激的主要內(nèi)源性活性因子，MDA是活性氧介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化降解產(chǎn)物，SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，HO-1和NQO-1是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)通路Nrf2/Keap1下游靶基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺組大鼠動(dòng)情周期紊亂，血清FSH、LH、MDA水平升高，血清AMH、E2、SOD、T-AOC水平降低，卵巢組織中生長(zhǎng)卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡數(shù)量增多，卵巢組織中HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)下調(diào)，表明DOR大鼠存在卵巢氧化應(yīng)激損傷。

卵巢的抗氧化系統(tǒng)直接影響卵泡活性氧和抗氧化酶的種類與水平，從而對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡以及卵泡閉鎖產(chǎn)生不同的影響。近年來(lái)中西醫(yī)干預(yù)DOR 氧化損傷機(jī)制的研究逐漸增多，其中中藥復(fù)方和單體、艾灸、針刺等可通過(guò)多環(huán)節(jié)、多途徑作用減輕自由基對(duì)卵巢的損傷，提高卵巢抗氧化能力，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[13]。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，灸“足三里”可提高圍絕經(jīng)期大鼠血清SOD活性，降低血清MDA水平，上調(diào)卵巢組織中HO-1和NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。方晨晨等[15]研究指出，針刺腎俞、關(guān)元、中脘穴可降低DOR大鼠血清MDA水平，升高血清SOD水平，上調(diào)卵巢組織中Bcl-2蛋白表達(dá)，提高大鼠抗卵巢氧化應(yīng)激的能力，抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)關(guān)于DOR的有關(guān)論述可見(jiàn)于“經(jīng)水早斷”“經(jīng)水過(guò)少”“閉經(jīng)”“不孕”等疾病中。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主生殖，腎精滋養(yǎng)五臟，五臟氣血充養(yǎng)腎精腎氣，腎與五臟、精血互生。若婦人年未老而腎精和沖任氣血提前衰少，五臟氣血生化乏源，便會(huì)出現(xiàn)DOR相關(guān)臨床癥狀。補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法中熟地、山藥、山茱萸補(bǔ)腎生精，加菟絲子、補(bǔ)骨脂平補(bǔ)腎陰腎陽(yáng)，枸杞子平補(bǔ)肝腎；當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地養(yǎng)血活血，精血互生，補(bǔ)血以生精；黨參、白術(shù)、黃芪健脾益氣，脾氣健則血生；香附行氣解郁，善行血中之氣，使補(bǔ)而不滯。全方補(bǔ)腎生精，健脾益氣，養(yǎng)血活血，行氣解郁，調(diào)補(bǔ)沖任。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各藥物組大鼠動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)；補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中劑量組大鼠血清FSH、LH、MDA水平均明顯降低，血清E2、SOD、GSH、T-AOC水平均明顯升高；卵巢內(nèi)生長(zhǎng)卵泡數(shù)量增多，閉鎖卵泡數(shù)量減少；補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方高劑量組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量、補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方低劑量組NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量及補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血方中、高劑量組HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高。表明補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法可調(diào)節(jié)DOR大鼠性激素分泌，改善大鼠卵巢儲(chǔ)備功能，提高卵巢抗氧化能力。

綜上所述，補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法可能通過(guò)提高卵巢抗氧化能力，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，減少卵泡閉鎖，從而改善卵巢儲(chǔ)備功能。本研究為臨床補(bǔ)腎生精調(diào)和氣血法治療DOR患者，延緩卵巢功能減退提供了一定理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。