陸炎松，黃旭光，楊思霞，黃麗丹，趙建文，姜立甫

（1.南寧市園林科研所，廣西 南寧 530011；2.南寧市綠化工程管理中心，廣西 南寧 530011）

植物生長離不開土壤，土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的一部分，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化循環(huán)、抗干擾能力、系統(tǒng)穩(wěn)定性以及可持續(xù)利用中占據(jù)主導地位[1]。根際作為連接土壤與植物的橋梁，其所含微生物種類眾多，按對植物的作用可分為有益微生物和有害微生物[2]。根際有益微生物通常通過產(chǎn)生激素類物質(zhì)、促進植物養(yǎng)分吸收、誘導植株增強抗性等直接作用方式和抑制病原菌生長的間接作用方式促進植物生長[3]。

天桃木Mangifera persiciformis為漆樹科Anacardiaceae杧果屬Mangifera常綠闊葉喬木[4]，樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的街道綠化樹種，作為南寧市市樹，被廣泛應用在南寧市市政綠化工程中。但由于天桃木苗木從苗木基地移植至苗圃假植時成活率較低，而且愈后不良率高，造成除市政工程以外很少有住宅區(qū)、公園等種植天桃木[5]。近年來，國內(nèi)外學者對于天桃木的研究主要集中在移植技術及水分利用效率等方面[6-7]，而對于天桃木土壤微生物方面的研究還未見報道。本研究采用第三代高通量測序技術，比較了不同地區(qū)原生天桃木土壤細菌群落的多樣性和優(yōu)勢菌群，并通過測定土壤化學性質(zhì)，探究土壤化學性質(zhì)對天桃木土壤細菌群落多樣性的影響，為挖掘有益微生物功能促進天桃木復壯提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

廣西南寧、崇左、百色等地為種植天桃木較多且適宜天桃木生長的區(qū)域，本研究在以上地區(qū)共設置4個樣地。研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)西南部，地理坐標為22.522°～ 23.758° N，106.796°～ 108.663° E，屬亞熱帶季風氣候，夏季氣溫高、降雨多、日照時間長，冬季日照時間短、天氣干暖。年均溫為21.7～ 22.1℃，年均降水量為1 093～ 1 295 mm。研究區(qū)概況見表1。

表1 研究區(qū)概況Table 1 Information of research areas

1.2 土壤樣品采集與處理

2020年6月，分別在每個樣地設置3個20 m×20 m典型樣方，先去除樣方內(nèi)的地表雜物，然后以天桃木的主莖為中心在50～ 80 cm半徑范圍內(nèi)取土。采用土鉆法在每個樣方內(nèi)用“S”形采集5個點的0～ 20 cm土壤樣品，每個樣地共采集15個土樣，挑去石塊、根系等雜物，將其混勻后用“四分法”取得1 kg的鮮土作為1個混合土樣，4個樣地共得到4個混合土樣。將混合土樣裝入無菌自封袋中，于冰盒中帶回實驗室。每份混合土樣一部分自然風干后過2 mm篩，供土壤理化性質(zhì)測定使用；另一部分鮮樣置于－80℃冰箱保存，供微生物測序分析使用。

1.3 測定方法

土壤理化性質(zhì)測定：土壤pH采用水土比例1∶2.5玻璃電極法測定；土壤有機碳（Soil organic carbon,SOC）含量采用重鉻酸鉀-水合加熱法測定；土壤全N（Total nitrogen,TN）含量采用凱氏定氮法測定；土壤全P（Total phosphorous，TP）含量采用鉬銻抗比色法測定；土壤堿解N（Available nitrogen,AN）含量采用堿解擴散法測定；土壤有效P（Available phosphorous,AP）含量采用氟化銨—鹽酸浸提，鉬銻抗比色，紫外分光光度法測定；土壤速效K（Available potassium,AK）含量采用中性乙酸銨溶液浸提，火焰光度計法測定[8]。

土壤DNA提取純化：采用CTAB方法提取樣本總DNA[9]。用Qubit2.0檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA樣品濃度＞10 ng·μL-1，樣品純度有明顯條帶；瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，無降解，符合接下來的測序條件。

PCR擴增及測序：細菌的PCR擴增及測序服務由北京擎科生物科技有限公司完成。擴增引物為27F（16S-F）：AGRGTTTGATYNTGGCTCAG和1492R（16S-R）：TASGGHTACCTTGTTASGACTT。擴增條件設置：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。提取樣品總DNA后，根據(jù)16S全長引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫（SMRTBell），對建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，并對質(zhì)檢合格的文庫用PacBioSequel平臺進行測序。

1.4 物種注釋與豐度計算

使用Limav 1.7.0軟件，通過Barcode對CCS進行識別，得到Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；對Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)進行過濾，得到有效序列；使用UCHIMEv 4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Optimization-CCS序列。使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，并基于Silva（細菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。使用Mothur（Version V.1.30）軟件計算Chao 1指數(shù)和Simpson指數(shù)等Alpha多樣性指數(shù)。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進行處理，用DPS 9.01進行單因素方差分析、多重比較分析（LSD法）。使用Canoco 4.5軟件對土壤環(huán)境因子和細菌群落進行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學性質(zhì)分析

由表2可見，4個樣地的土壤pH均呈弱酸性，A1、A2、B1的土壤pH之間差異均不顯著，但其與C1之間均差異顯著（P＜0.05）。B1、C1的土壤SOC、TN、AP含量之間均差異不顯著，其土壤SOC、TN含量均顯著高于A1和A2的（P＜0.05），但土壤AP含量卻顯著低于A1和A2的（P＜0.05）。4個樣地的土壤TP、AN含量差異均達到顯著水平（P＜0.05）。

表2 不同樣地土壤的化學性質(zhì)Table 2 Chemical properties of the soil at different research areas

2.2 細菌多樣性指數(shù)

通過高通量測序技術對土壤樣品的微生物細菌部分進行測序，共獲得有效序列27 017條，片段長度在1 454～ 1 457 bp，測序覆蓋度在97.90%～ 99.13%之間?；谄錅y序深度基本能夠反映該區(qū)域所涵蓋的細菌群落的結(jié)構(gòu)以及種類等特性，可以定量比較整個群落組成和多樣性的相對差異。

不同樣品的Alpha多樣性指數(shù)，如Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表群落物種豐富度，其數(shù)值越大，說明菌群的豐度越高；Shannon豐富度指數(shù)代表群落物種多樣性，Simpson優(yōu)勢度指數(shù)代表常見物種[10]。研究結(jié)果表明（表3），Simpson指數(shù)，A2與C1之間差異不顯著；ACE指數(shù)，A1與A2、B1之間差異不顯著，但均顯著高于C1（P＜0.05）；Chao1指數(shù)，A1、A2、B1之間差異不顯著，但均顯著高于C1（P＜0.05）；Shannon指數(shù)，A1、A2、B1之間差異不顯著，均與C1之間差異顯著（P＜0.05）。這說明在4個樣地中C1的細菌群落豐富度和多樣性均為最低。在4個樣地中，C1的土壤pH值最高，林齡最大，這可能是導致細菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性低的主要原因。

表3 土壤微生物多樣性指數(shù)Table 3 Soil bacterial diversity index

2.3 門水平上土壤細菌群落結(jié)構(gòu)相對豐度分析

在門水平上，4個樣地的土壤中共檢測出23門細菌，其中在A1樣地土壤中有21門，在A2樣地土壤中有21門，在B1樣地土壤中有20門，在C1樣地土壤中有21門。由圖1可知，相對豐度排名前10位的依次為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteriota、疣微菌門Verrucomicrobia、浮霉菌門Planctomycetota、擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、硝化螺旋菌門Nitrospirae、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、Myxococcota。

圖1 土壤細菌門水平相對豐度Figure 1 Relative abundance of soil bacteria at the phylum level

2.4 屬水平上土壤細菌群落結(jié)構(gòu)相對豐度分析

在屬水平上，4個樣地的土壤中共檢測出118屬細菌。其中在A1樣地土壤中有96屬，在A2樣地土壤中有100屬，在B1樣地土壤中有89屬，在C1樣地土壤中有70屬。由圖2可知，相對豐度排名前10位的物種依次為Vicinamibacter、疣微菌屬Pedosphaera、硝化螺旋菌屬Nitrospira、芽單胞菌屬Gemmatimonas、Pseudolabrys、土生單胞菌屬Terrimonas、Candidatus Udaeobacter、Ramlibacter、Gaiella、Aeromonas。其中Vicinamibacter在各樣地中均具有絕對優(yōu)勢。

圖2 土壤細菌屬水平相對豐度Figure 2 Relative abundance of soil bacteria at the genus level

2.5 種水平上土壤細菌群落結(jié)構(gòu)相對豐度分析

在種水平上，4個樣地的土壤中共檢測出123種細菌。其中在A1樣地土壤中有92種，在A2樣地土壤中有94種，在B1樣地土壤中有85種，在C1樣地土壤中有67種。Vicinamibacter silvestris、疣微菌Pedosphaera parvula、芽單胞菌Gemmatimonassp.、土生單胞菌Terrimonassp.、Candidatus Udaeobacter copiosus、Gaiella occulta、硝化螺旋菌Nitrospira japonica、Pseudolabrys taiwanensis是不同樣地天桃木根際土壤細菌的優(yōu)勢菌群。

圖3 土壤細菌種水平相對豐度Figure 3 Relative abundance of soil bacteria at the species level

2.6 優(yōu)勢細菌門、屬、種相對豐度與土壤化學性質(zhì)之間的相關性

對優(yōu)勢細菌門、優(yōu)勢細菌屬和優(yōu)勢細菌種的相對豐度和土壤化學性質(zhì)進行冗余分析（圖4）。結(jié)果顯示，軸Ⅰ和軸Ⅱ門、屬、種的累計解釋變異量分別達78.62%、82.42%和79.85%。在門和屬水平上，土壤AP含量、AK含量、pH對細菌群落組成影響較大。在種水平上，土壤pH、AP含量、TP含量對細菌群落種水平組成影響較大。

圖4 土壤化學因子和優(yōu)勢細菌門、屬、種相對豐度冗余度分析Figure 4 Redundancy analysis on soil chemical properties and relative abundance of dominant bacterial phylum,genera and species

對優(yōu)勢細菌類群和土壤化學性質(zhì)進行Pearson相關性分析（表4）。結(jié)果表明，在門水平上，酸桿菌門的相對豐度與土壤pH呈極顯著正相關（P<0.01）；疣微菌門的相對豐度與土壤AP含量呈顯著正相關（P<0.05）；擬桿菌門的相對豐度與土壤SOC、TN含量呈顯著負相關（P<0.05），與土壤AP含量呈極顯著正相關（P<0.01）；放線菌門的相對豐度與土壤pH、土壤TP含量呈極顯著正相關（P<0.01），與土壤AN含量呈顯著正相關（P<0.05）；硝化螺旋菌門的相對豐度與土壤AP含量呈極顯著正相關（P<0.01）；芽單胞菌門的相對豐度與土壤SOC、TN含量呈顯著正相關（P<0.05）；Myxococcota與土壤TP含量呈顯著負相關（P<0.05）。在屬水平上，Vicinamibacter的相對豐度與土壤AK含量呈顯著正相關（P<0.05）；硝化螺旋菌屬的相對豐度與土壤AP含量呈極顯著正相關（P<0.01）；芽單胞菌屬的相對豐度與土壤SOC含量呈顯著正相關（P<0.05）；Pseudolabrys的相對豐度與土壤pH呈極顯著正相關（P<0.01），與土壤TP含量呈顯著正相關（P<0.05）。在種水平上，Vicinamibactersilvestris的相對豐度與土壤AK含量呈顯著正相關（P<0.05）；芽單胞菌的相對豐度與土壤SOC含量呈顯著正相關（P<0.05）；硝化螺旋菌的相對豐度與土壤TP、AN含量呈極顯著正相關（P<0.01）；Pseudolabrys taiwanensis的相對豐度與土壤pH、土壤TP含量呈顯著正相關（P<0.05）。

表4 優(yōu)勢細菌類群與土壤化學因子相關性分析Table 4 Correlation analysis between dominant bacteria groups and soil chemical properties

3 討論

3.1 土壤化學性質(zhì)對天桃木土壤細菌群落多樣性的影響

不同土壤細菌類群的生存和繁衍需要不同的環(huán)境條件。冗余分析結(jié)果表明，土壤pH、AP含量和AK含量對細菌群落門水平及屬水平影響較大，土壤pH、AP含量和TP含量對細菌群落種水平組成影響較大。土壤pH 在土壤生物地球化學循環(huán)過程中起著重要作用，對土壤中理化反應都具有重要的調(diào)節(jié)作用，是影響細菌分布的重要因子[11]。土壤中的P也是土壤細菌的重要營養(yǎng)來源，P的多少影響土壤細菌在土壤中的生存和繁殖。安然等研究發(fā)現(xiàn)土壤AP含量變化會引起土壤細菌群落的變化[12]。本研究中，土壤pH、AP含量對細菌群落門、屬、種水平均影響較大，印證了這一說法。微生物分泌有機酸產(chǎn)生的溶磷作用，一方面與分泌的有機酸的種類和數(shù)量有關，另一方面與磷酸根結(jié)合的陽離子有關。如果微生物分泌的有機酸多，土壤中的Ca-P化合物也多，溶解釋放的磷也相對較多[13]。本試驗中A1、A2樣地土壤中的TP含量顯著高于B1、C1樣地，AP含量卻顯著低于B1、C1樣地，可能是由于A1、A2樣地土壤中溶磷微生物分泌的有機酸較多，且A1、A2樣地屬同一地區(qū)，其土壤中可能含有較多的Ca-P化合物。

3.2 天桃木土壤樣本高豐度微生物潛在功能探討

在門水平上，變形菌門是4個樣地土壤中的第一大優(yōu)勢菌群。變形菌門成員在生態(tài)環(huán)境中分布廣泛。有研究表明，好氧甲烷氧化菌可分為14個屬，包括研究較為深入的隸屬于變形菌門Alpha和Gamma綱的細菌，以及屬于疣微菌門的極端嗜熱嗜酸甲烷氧化菌[14]。甲烷氧化菌是自然界中唯一的甲烷生物匯，其氧化作用可消耗大氣中至少10%的甲烷[15]。本研究土樣中鑒定的優(yōu)勢菌株Pseudolabrys taiwanensis隸屬于Alphaproteobacteria綱，菌株Aeromonassp.隸屬于Gammaproteobacteria綱，其可能具備氧化甲烷的功能。酸桿菌門為4個樣地的第二大優(yōu)勢菌群。酸桿菌門菌株最早由Kishimoto等[16]在1991年分離自酸性礦山環(huán)境，并于1995年將酸桿菌劃分為新的細菌類群[17]。目前，基于16SrRNA基因序列將酸桿菌門細菌劃分為26個亞群，即Gp1～ 26[18]。酸桿菌廣泛分布在自然界中，在土壤中的數(shù)量約占細菌總量的20%～ 50%，與變形桿菌不相上下[19]。酸桿菌門可培養(yǎng)菌株經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，可以降解植物纖維素[20]、參與鐵循環(huán)[21]及單碳化合物的代謝過程[22]。但相對于自然環(huán)境中酸桿菌的多樣性而言，可培養(yǎng)菌株依然很少且大部分屬于Gp1亞群[19]。本研究中的優(yōu)勢菌株Vicinamibacter silvestris屬于Gp6亞群[23]，其是否具備其它可培養(yǎng)菌株的功能還有待研究。優(yōu)勢菌株硝化螺旋菌隸屬于硝化螺旋菌屬。硝化螺旋菌屬細菌可以將土壤中的亞硝酸氧化成硝酸鹽，而硝酸鹽是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此，土壤中硝化螺旋菌的增加可以間接地增加土壤氮肥力[24]。放線菌作為一類具備生物防治潛力的微生物資源，其可以產(chǎn)生種類豐富的抗生素和其他生物活性代謝產(chǎn)物[25]。目前應用較多的放線菌隸屬于鏈霉菌屬[26]，本研究中的優(yōu)勢菌株Gaiella occulta隸屬于Gaiella屬，最顯著的特征是存在其他細菌中沒有的iso內(nèi)部支化脂肪酸[27]。根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是一類能高密度定殖在植物根際的微生物，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進植物生長并增加作物產(chǎn)量的作用。相關研究表明，Terrimonas屬的T.aquatica、T.arctica、T.lutea等菌株具有促進根系發(fā)育、增加葉面積等改善植物農(nóng)藝性狀的功能[28]。本研究中的優(yōu)勢菌株土生單胞菌Terrimonassp.隸屬Terrimonas屬，其可能也具備促生功能。

馬尾松Pinus massoniana[29]、香榧Torreya grandis‘Merrillii’[30]、鹽穗木Halostachys caspica[31]根際土壤細菌群落組成主要是由變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門等組成，與本研究結(jié)果相似，但在屬水平上的細菌群落組成差異較大。以上樹種根際土壤細菌微生物多樣性分析均未在種水平上進行分析。本研究利用第三代高通量測序技術，可在種水平上對土壤細菌群落多樣性進行分析，為天桃木根際土壤有益微生物的開發(fā)利用創(chuàng)造了條件。

廣西不同地區(qū)天桃木土壤細菌優(yōu)勢門類群主要包括變形菌門、酸桿菌門，優(yōu)勢屬類群主要包括Vicinamibacter、疣微菌屬，優(yōu)勢種類群主要包括酸桿菌、疣微菌。土壤pH、有效P含量對不同水平的細菌群落組成均具有影響。