蔣恩惠 劉 媛 李 潔 馬思佳 李向臣* 藍(lán)賢勇**

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，杭州 311300；3.浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300)

外界環(huán)境的不良刺激如運(yùn)輸、免疫治療、化學(xué)藥品和飼養(yǎng)密度過(guò)大等，都會(huì)導(dǎo)致畜禽產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而引起畜禽應(yīng)激綜合征這一常見(jiàn)問(wèn)題[1]。氧化應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及生物膜系統(tǒng)發(fā)生損傷，并在一定程度上降低動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)，如影響機(jī)體內(nèi)脂肪沉積等。因此，在全面“禁抗”的前提下，適當(dāng)?shù)乩弥参锾崛∥锾岣咝笄莸目寡趸芰?，減少氧化應(yīng)激造成的損失，是我國(guó)畜牧業(yè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的關(guān)鍵[2]。Zuk等[3]成功從人體脂肪組織分離純化得到一種在體外培養(yǎng)條件下能夠連續(xù)貼壁生長(zhǎng)，并且可以向成骨、成脂、成肌等細(xì)胞分化的干細(xì)胞，由于其來(lái)源于脂肪組織，作為脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞故得名“脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)”。ADSCs是一類間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。Abdik等[4]研究表明，機(jī)體內(nèi)脂肪的形成主要是ADSCs的分化過(guò)程，ADSCs在脂肪沉積中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而ADSCs發(fā)生氧化應(yīng)激及凋亡會(huì)嚴(yán)重影響肌內(nèi)脂肪含量[5]，進(jìn)而影響肉質(zhì)和風(fēng)味，所以尋找一種有效抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激的物質(zhì)變得尤為重要。

羥自由基是一種毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，可以參與機(jī)體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移、脫氫等多種反應(yīng)，對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等物質(zhì)造成不可逆的氧化損傷。過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)作為一種強(qiáng)氧化劑[6]可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)Fe3+反應(yīng)生成羥自由基，從而引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，并且H2O2性質(zhì)較穩(wěn)定，在機(jī)體內(nèi)不易分解，來(lái)源廣泛易于獲得，在誘導(dǎo)動(dòng)物組織或細(xì)胞氧化損傷模型中已成為一種常用試劑[7-8]。根皮素(phloretin，PT)是法國(guó)化學(xué)家于19世紀(jì)30年代在蘋果樹(shù)皮中提取的一種具有二氫查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類植物多酚[9-10]，化學(xué)簡(jiǎn)式為C5H14O5[11]，化學(xué)名為2,4,6-三羥基-3-(4-羥基苯基)苯丙酮。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PT在桑樹(shù)皮、荔枝果皮、海棠等多種植物中廣泛存在[12]，并且在抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤、抗癌等方面均有較強(qiáng)的生理功能[13]。已有研究表明，PT可以清除機(jī)體內(nèi)多余的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)，增強(qiáng)抗氧化酶系中如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[14-16]。在抗凋亡方面，PT使促凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)和抗凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)在線粒體內(nèi)重新分布，改變線粒體膜電位及膜通透性，進(jìn)而影響線粒體功能，促進(jìn)線粒體下游基因細(xì)胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)激活[17]。多項(xiàng)研究表明，PT可以有效逆轉(zhuǎn)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞或組織發(fā)生氧化應(yīng)激或凋亡[18-19]，但是有關(guān)PT對(duì)牛ADSCs氧化應(yīng)激影響的研究相對(duì)較少。因此，本研究用H2O2誘導(dǎo)牛ADSCs，模擬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激及凋亡時(shí)的狀態(tài)，用PT對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)一步探究PT對(duì)牛ADSCs氧化損傷是否具有減緩作用，以期為改善牛脂肪沉積提供一定的理論依據(jù)，進(jìn)而為改善牛肉肉質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

胎牛血清(FBS)(貨號(hào)：ST30-3302)購(gòu)自PAN-Biotech公司；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30023.01B)購(gòu)自Hyclone公司；Ⅳ型膠原酶(貨號(hào)：C8160-100 mg)購(gòu)自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司；雙抗(貨號(hào)：15140-122)、0.25%-乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶(貨號(hào)：25200-56)購(gòu)自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)(貨號(hào)：CBS101.05)購(gòu)自CellMax公司；4%多聚甲醛(貨號(hào)：P1110)、SOD檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BC0175)、MDA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BC0025)和ROS檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：CA1410)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CD29抗體(貨號(hào)：bs-20630R)、CD44抗體(貨號(hào)：BH0185)、CD73抗體(貨號(hào)：bs-4834R)、山羊抗兔二抗(貨號(hào)：bs-0295G)、山羊抗鼠二抗(貨號(hào)：bs-0295M)和增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(貨號(hào)：BA00208)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Vimentin抗體(貨號(hào)：ab8978)購(gòu)自Abcam公司；曲拉通X-100(Triton X-100)(貨號(hào)：T109026)購(gòu)自Aladdin公司；牛血清白蛋白(BSA)(貨號(hào)：A8806)和PT(貨號(hào)：60-82-2)均購(gòu)自Sigma公司；30% H2O2(貨號(hào)：10011218)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、高速低溫離心機(jī)均購(gòu)自Thermo Fisher公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀均購(gòu)自Bio-Rad公司；激光共聚焦熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自青島海爾特種電器有限公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛ADSCs的分離培養(yǎng)

參考前人的方法進(jìn)行牛ADSCs的分離[20-21]：選用1月齡西門塔爾牛犢牛作為脂肪組織的供體，取其腹股溝脂肪組織，利用75%酒精進(jìn)行消毒；剪成肉糜后加入Ⅳ型膠原酶，放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min，期間每隔5 min進(jìn)行吹打，使其充分消化。然后加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS+1%青-鏈霉素雙抗)終止消化，細(xì)胞篩過(guò)濾后200×g離心15 min，重懸細(xì)胞并接種至培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將其標(biāo)記為P0。待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代，用0.25%-EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，200×g離心5 min，剩余步驟同上并標(biāo)記為P1，以此類推，每傳1次代，細(xì)胞代數(shù)增加1代。選用P1～P10代細(xì)胞用于形態(tài)學(xué)觀察，選用P3～P5代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 牛ADSCs形態(tài)學(xué)觀察

選取牛ADSCs P1～P10代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～90%時(shí)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 牛ADSCs表面標(biāo)記蛋白鑒定

通過(guò)免疫熒光鑒定牛ADSCs表面標(biāo)記蛋白[22]。待牛ADSCs細(xì)胞匯合度達(dá)到60%左右時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS清洗后加入10%甲醇在-20 ℃冰箱中孵育10 min；PBS清洗后加入免疫熒光封閉液(PBS+10%FBS+3%BSA+0.3%Triton X-100)封閉2 h；加入一抗稀釋液(PBS+3%BSA+0.3%Triton X-100+相應(yīng)一抗)在-20 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；PBS清洗后加入二抗稀釋液(稀釋比例為1∶1 000)室溫避光孵育2 h；PBS清洗后加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色劑室溫避光孵育30 min；吸去DAPI，加入抗熒光淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 H2O2構(gòu)建牛ADSCs氧化應(yīng)激模型

待P4代牛ADSCs在96孔板內(nèi)培養(yǎng)密度至80%左右時(shí)，用不同濃度[0(空白組)、100、200、500、1 000 μmol/L]H2O2處理牛ADSCs 24 h(參考前人氧化應(yīng)激造模時(shí)間，選用24 h作為H2O2處理細(xì)胞時(shí)間[23])。處理24 h后換液，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑后放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。根據(jù)結(jié)果選擇適宜濃度的H2O2用于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)PT對(duì)牛ADSCs存活率的影響

待牛ADSCs在96孔板內(nèi)培養(yǎng)密度至80%左右時(shí)，用不同濃度[0(空白組)、1、10、50、100 μmol/L]PT處理牛ADSCs 4 h。處理后換液，每孔加入10 μL CCK-8試劑后放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率[16,23]。根據(jù)結(jié)果選擇適宜濃度的PT用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

待牛ADSCs在6孔板內(nèi)培養(yǎng)密度至80%左右時(shí)，先用不同濃度PT(0、10、50 μmol/L)預(yù)處理牛ADSCs 4 h，對(duì)牛ADSCs進(jìn)行預(yù)保護(hù)；再利用500 μmol/L H2O2處理牛ADSCs 24 h。在此過(guò)程中，按照不同處理將細(xì)胞分為4組：空白組(0 μmol/L PT預(yù)保護(hù)，0 μmol/L H2O2處理)、氧化應(yīng)激組(0 μmol/L PT預(yù)保護(hù)，500 μmol/L H2O2處理)、10 μmol/L PT預(yù)保護(hù)組(10 μmol/L PT預(yù)保護(hù)，500 μmol/L H2O2處理)、50 μmol/L PT預(yù)保護(hù)組(50 μmol/L PT預(yù)保護(hù)，500 μmol/L H2O2處理)。收集細(xì)胞后重懸；利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞(冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)；4 ℃，8 000×g離心10 min后取上清。參照MDA和SOD檢測(cè)試劑盒操作步驟逐步進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞中MDA含量和SOD活性[16]。

1.2.7 牛ADSCs內(nèi)ROS含量的測(cè)定

待P4代牛ADSCs在12孔板內(nèi)培養(yǎng)密度至80%左右時(shí)，按照1.2.6的方法分組處理細(xì)胞。隨后加入10 μL 2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)后放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗殘留的DCFH-DA，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。利用Imagin J軟件將熒光強(qiáng)弱量化，熒光強(qiáng)弱可反映活細(xì)胞內(nèi)ROS含量[16]。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

待牛ADSCs在6孔板內(nèi)培養(yǎng)密度至80%左右時(shí)，按照1.2.6的方法分組處理細(xì)胞。隨后提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR所需引物信息如表1所示。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 25.0軟件單因素方差(one-way ANOVA)程序分析組間數(shù)據(jù)的差異顯著性，分析結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，所得結(jié)果使用Graphpad Prism軟件繪制圖表。其中，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。各指標(biāo)至少重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛ADSCs形態(tài)觀察

部分代次的牛ADSCs形態(tài)如圖1所示。牛ADSCs剛分離時(shí)雜質(zhì)較多，呈圓形散布于培養(yǎng)基內(nèi)；貼壁后細(xì)胞呈紡錘形或梭形，數(shù)量稀疏，生長(zhǎng)方向多變；隨著細(xì)胞代次的增加，雜質(zhì)慢慢減少甚至消失，生長(zhǎng)方向趨向于統(tǒng)一，生長(zhǎng)速度逐漸增快；但在P10代細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)速度減慢、細(xì)胞空泡化等現(xiàn)象。

圖A～I(xiàn)依次為牛ADSCs P0、P1、P3、P5、P6、P7、P8、P9、P10代形態(tài)。Figures A to I were the morphology of cattle ADSCs for P0, P1, P3, P5, P6, P7, P8, P9 and P10 generations in turn.圖1 牛ADSCs形態(tài)(標(biāo)尺為100 μm)Fig.1 Morphology of cattle ADSCs (scale bar=100 μm, 10×)

2.2 牛ADSCs表面標(biāo)記蛋白免疫熒光鑒定

表面標(biāo)記蛋白CD29、CD44、CD73和Vimentin多在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈綠色熒光；DAPI主要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行著色，呈藍(lán)色熒光。牛ADSCs表面標(biāo)記蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果如圖2所示。染色結(jié)果顯示，牛ADSCs中CD29、CD44、CD73和Vimentin蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，說(shuō)明從脂肪組織獲得的牛ADSCs具有一般間充質(zhì)干細(xì)胞的表面蛋白。

圖2 牛ADSCs表面標(biāo)記蛋白免疫熒光鑒定(標(biāo)尺為500 μm)Fig.2 Immunofluorescence identification of cattle ADSCs surface marker proteins (scale bar=500 μm, 20×)

2.3 牛ADSCs氧化應(yīng)激模型的建立

如圖3所示，與空白組相比，100、200 μmol/L H2O2對(duì)細(xì)胞存活率為產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，當(dāng)H2O2濃度大于500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01)，H2O2濃度為1 000 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率過(guò)小，不足空白組的20%，此時(shí)H2O2濃度過(guò)大并且對(duì)細(xì)胞造成了不可逆的損傷。故本試驗(yàn)采用濃度為500 μmol/L的H2O2構(gòu)建牛ADSCs氧化應(yīng)激模型。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“*”表示與空白組相比差異極顯著(P<0.01)，“**”表示與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖4同。Date columns with “*” mean significant difference (P<0.01) and with “**” mean extremely significant difference (P<0.01) compared with blank group. The same as Fig.4.圖3 H2O2對(duì)牛ADSCs存活率的影響Fig.3 Effects of H2O2 on viability of cattle ADSCs

2.4 PT對(duì)牛ADSCs存活率的影響

利用CCK-8試劑盒檢測(cè)PT對(duì)牛ADSCs存活率的影響，結(jié)果如圖4所示。與空白組相比，PT濃度小于100 μmol/L時(shí)不影響細(xì)胞存活率。當(dāng)PT濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。故本試驗(yàn)采用濃度為10、50 μmol/L的PT對(duì)牛ADSCs進(jìn)行預(yù)保護(hù)，應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 PT對(duì)牛ADSCs存活率的影響Fig.4 Effects of PT on viability of cattle ADSCs

2.5 PT緩解H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化

PT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA含量和SOD活性的影響如圖5所示。由圖5-A可知，與氧化應(yīng)激組相比，PT濃度為10、50 μmol/L時(shí)均可顯著降低牛ADSCs內(nèi)MDA含量(P<0.05)；由圖5-B可知，與氧化應(yīng)激組相比，PT濃度為50 μmol/L時(shí)可以顯著升高牛ADSCs內(nèi)SOD活性(P<0.05)。

2.6 PT緩解H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs內(nèi)ROS含量變化

PT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs內(nèi)ROS含量的影響如圖6所示。DCFH-DA是一種滲透入細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的探針，在細(xì)胞內(nèi)可以被水解成2′,7′-二氯二氫熒光素(DCFH)，ROS可以氧化DCFH生成有熒光的2′,7′-二氯熒光素(DCF)，因此可以依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果顯示，與氧化應(yīng)激組相比，PT濃度為10、50 μmol/L時(shí)均能極顯著降低牛ADSCs內(nèi)ROS含量(P<0.01)，且濃度為50 μmol/L時(shí)作用更明顯。

2.7 PT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs凋亡的影響

PT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs凋亡的影響如圖7所示。與空白組相比，500 μmol/L H2O2處理顯著上調(diào)牛ADSCs內(nèi)促凋亡基因Bax和Caspase-3的表達(dá)(P<0.05)，極顯著下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)(P<0.01)；而在加入10、50 μmol/L PT與H2O2共處理時(shí)，PT并沒(méi)有顯著緩解ADSCs的凋亡(P>0.05)。

圖7 PT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的牛ADSCs凋亡的影響Fig.7 Effects of PT on apoptosis induced by H2O2 in cattle ADSCs

3 討 論

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)的一種不良狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，氧化作用大于抗氧化作用。機(jī)體在進(jìn)行呼吸代謝等生理過(guò)程時(shí)都會(huì)產(chǎn)生自由基[24-25]，一定量的自由基在體內(nèi)是必須的，雖然會(huì)造成組織損傷，但是具有刺激損傷修復(fù)作用；然而，當(dāng)過(guò)量的自由基產(chǎn)生時(shí)，不僅會(huì)造成組織損傷，還會(huì)破壞修復(fù)過(guò)程，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ADSCs是從脂肪組織中提取的成體干細(xì)胞，在脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)在組織損傷修復(fù)等方面具有不可忽視的重要性，因而在研究如何改善氧化應(yīng)激及凋亡從而提高肉質(zhì)時(shí)，ADSCs是一種關(guān)鍵的試驗(yàn)材料。H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，機(jī)體在正常狀態(tài)下，只有2.7%的H2O2可以被降解[26]，因此，H2O2為構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的首選材料。Liu等[27]采用600 μmol/L H2O2刺激H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型；Kim等[28]采用300 μmol/L H2O2刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型；Chen等[29]采用100 μmol/L H2O2刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。這些研究說(shuō)明不同細(xì)胞對(duì)H2O2的敏感性不同，選取細(xì)胞類型不同，構(gòu)建氧化應(yīng)激模型所需要的H2O2處理?xiàng)l件也不盡相同。因此，本試驗(yàn)選用不同濃度(100、200、500、1 000 μmol/L)的H2O2刺激牛ADSCs發(fā)生氧化應(yīng)激，通過(guò)CCK-8法確定構(gòu)建牛ADSCs氧化應(yīng)激模型的適宜H2O2濃度，結(jié)果表明，500～1 000 μmol/L的H2O2均可極顯著降低細(xì)胞存活率，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，牛ADSCs的存活率過(guò)低，不足初始細(xì)胞數(shù)量的20%，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的損傷，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。而當(dāng)H2O2濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)，牛ADSCs的存活率達(dá)到初始細(xì)胞的60%～80%，所以選用該濃度作為構(gòu)建H2O2氧化應(yīng)激模型的H2O2濃度。當(dāng)用500 μmol/L H2O2刺激牛ADSCs時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量極顯著升高，SOD活性極顯著下降，說(shuō)明成功引起牛ADSCs產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“*”表示與氧化應(yīng)激組相比差異極顯著(P<0.01)，“**”表示與氧化應(yīng)激組相比差異極顯著(P<0.01)。圖5至圖7同。Date columns with “*” mean significant difference (P<0.01) and with “**” mean extremely significant difference (P<0.01) compared with oxidative stress group. The same as Fig.5 to Fig.7.圖5 牛ADSCs內(nèi)MDA含量和SOD活性Fig.5 MDA content and SOD activity in cattle ADSCs

A:不同組牛ADSCs內(nèi)ROS含量；B：圖A中熒光強(qiáng)度量化柱狀圖。A: ROS content of cattle ADSCs in different groups; B: quantitative histogram of fluorescence intensity in figure A.圖6 牛ADSCs內(nèi)ROS含量Fig.6 ROS content in cattle ADSCs

ROS是一類氧的單電子還原產(chǎn)物，機(jī)體代謝產(chǎn)生的ROS主要來(lái)源于線粒體，大約有2%的氧在線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)由于未傳遞到呼吸鏈而轉(zhuǎn)化為氧自由基[30]。過(guò)量ROS會(huì)造成DNA發(fā)生點(diǎn)突變、堿基的插入和缺失，造成DNA發(fā)生移碼突變，或者引起氨基酸肽鍵斷裂，形成蛋白質(zhì)交聯(lián)復(fù)合物改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，引起蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成機(jī)體死亡。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一[31-32]，它的形成會(huì)引起機(jī)體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)交聯(lián)聚合，加快機(jī)體氧化應(yīng)激速度。SOD作為抗氧化系統(tǒng)的第1道防線，可以通過(guò)歧化反應(yīng)催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和H2O2，是機(jī)體內(nèi)最重要的抗氧化酶，在抗氧化、抗癌和抗炎等方面均有重要作用[33-34]。因此本試驗(yàn)選取ROS、MDA含量和SOD活性這3個(gè)指標(biāo)來(lái)反映牛ADSCs氧化應(yīng)激的程度。在本試驗(yàn)中，10 μmol/L PT可以緩解牛ADSCs氧化應(yīng)激時(shí)MDA和ROS含量的變化，而50 μmol/L PT可以同時(shí)緩解MDA、ROS含量和SOD活性的變化。這說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下50 μmol/L PT是緩解牛ADSCs氧化應(yīng)激的最適濃度。

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡密不可分，氧化應(yīng)激可以通過(guò)內(nèi)源性和外源性2種途徑引起細(xì)胞凋亡[35]。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，凋亡相關(guān)基因如Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變。Bax和Bcl-2均為Bcl-2家族中的關(guān)鍵基因，Bax是一種促凋亡基因，發(fā)揮的主要功能有破壞線粒體合成ATP的功能，與呼吸鏈解偶聯(lián)，干擾氧化磷酸化作用[36]；Bcl-2是一種抗凋亡基因，發(fā)揮的主要功能有阻斷氧化劑對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的破壞，改變鈣通道蛋白分布從而影響物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)從而維持呼吸鏈，保護(hù)DNA、氨基酸等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變[37]。Caspase-3屬于半胱天冬酶(Caspase)基因家族,在凋亡過(guò)程中可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能[38]。本試驗(yàn)在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的同時(shí)也檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，H2O2處理使得牛ADSCs內(nèi)促凋亡基因Bax以及Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下降，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后可以引起細(xì)胞凋亡。此外，本研究還對(duì)PT抑制細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行了探索，但是并沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下PT并沒(méi)有明顯的抗凋亡作用。

PT的抗氧化應(yīng)激作用已經(jīng)被廣泛研究。在不同細(xì)胞中，PT可以降低ROS含量，提高SOD活性，抑制氧化應(yīng)激[13,16,18-19]。為了探究PT發(fā)揮作用的分子機(jī)制，Yang等[16]先用棕櫚酸對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行氧化應(yīng)激造模，隨后用適宜濃度PT處理該細(xì)胞恢復(fù)生理狀態(tài)，對(duì)空白組、氧化應(yīng)激造模組和恢復(fù)組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集于環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞骨架調(diào)控等信號(hào)通路；隨著進(jìn)一步探索，該研究還發(fā)現(xiàn)PT可以通過(guò)激活LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶-1(HO-1)信號(hào)通路改善HUVECs氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)PT在牛ADSCs中同樣具有抗氧化應(yīng)激的作用，其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。綜上所述，PT可以減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，但是對(duì)于其作用機(jī)制以及在畜牧業(yè)中的具體應(yīng)用還需進(jìn)行深度研究。

4 結(jié) 論

綜上可知，500 μmol/L H2O2處理牛ADSCs 24 h可以引起其發(fā)生氧化應(yīng)激。在牛ADSCs發(fā)生氧化應(yīng)激條件下，10 μmol/L PT預(yù)保護(hù)4 h可以降低牛ADSCs內(nèi)MDA和ROS含量，而50 μmol/L PT預(yù)保護(hù)4 h可以降低牛ADSCs內(nèi)MDA和ROS含量，提高SOD活性，說(shuō)明PT對(duì)牛ADSCs的氧化應(yīng)激具有抑制作用。