魏 翔 顏克濤 戴宇峰 華雪銘* 李 向 杭 瑩

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；4.王屋水庫管理所，龍口 265721；5.常州市天寧區(qū)鄭陸畜牧獸醫(yī)站，常州 213111)

維生素K是一種脂溶性維生素，是谷氨酰羧化酶(GGCX)羧化反應(yīng)的輔助因子，GGCX可以將維生素K依賴蛋白的谷氨酸殘基(Glu)羧化為γ-羧基谷氨酸(Gla)[1]。維生素K促進凝血酶原(凝血因子Ⅱ)的合成，并調(diào)節(jié)其他3種凝血因子(凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成，從而促進凝血，因此又被稱為凝血維生素。骨鈣素(BGP)、基質(zhì)Gla蛋白(MGP)和蛋白S是存在于骨骼內(nèi)的維生素K依賴蛋白，所以維生素K對于骨骼的生長發(fā)育有積極的作用[2-3]。

維生素K從結(jié)構(gòu)上來看有3種形式，它們共有甲萘醌基團。維生素K1和維生素K2是脂溶性維生素，在自然中本來就存在，維生素K3是人工合成的水溶性維生素。維生素K1主要由綠色植物合成[4-5]，維生素K2主要由微生物合成[6]。維生素K2具有一系列的形式，分子的側(cè)鏈上有多個重復(fù)的異戊烯基單位，因此維生素K2又被稱為MK-n，其中n表示異戊烯基單位數(shù)。目前在水產(chǎn)飼料中最常用的是維生素K3的復(fù)合物，以亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)和亞硫酸煙酰胺甲萘醌(MNB)最為常見。已有研究證實，飼料中的維生素K3需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為一種活性物質(zhì)(MK-4)后發(fā)揮作用，主要儲存在肝臟中[7-8]。

目前關(guān)于維生素K在水產(chǎn)動物上的研究主要集中在生理功能和需求量方面。由于水體環(huán)境復(fù)雜、物種不同、生長階段等因素不同，不同水生動物對維生素K的需求量差異很大。魚體攝入維生素K不足會導(dǎo)致組織出血和凝血時間延長等[9-11]。對底鳉(Fundulusheteroclitus)的研究表明，飼料中MSB缺乏或過量容易導(dǎo)致脊椎異常[12]。草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[14]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[15]、湖紅點鮭(Salvelinusnamaycush)[10]、石斑魚(Epinephelusmalabaricus)[15]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[16]、中國對蝦(Penaeuschinensis)[17]和斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[18]對維生素K的需求量已被確定分別為1.9 mg/kg、3.73～6.72 mg/kg、5.2 mg/kg、0.5～1.0 mg/kg、10.6 mg/kg、10.42 mg/kg、185 mg/kg和30 mg/kg。而斑點叉尾(Ietaluruspunetaus)[19]、五條(Seriolaquinqueradiata)[20]和大西洋鮭(SalmosalarL.)[21]，不需要在飼料中添加維生素K就可以滿足生長和生理需求。

消化和代謝是動物機體內(nèi)2個非常重要的過程。消化是指將食物溶解并降解為小分子化合物或元素，使其能夠順利通過腸壁并參與生理功能。代謝是生物體不斷進行物質(zhì)和能量交換的過程。已有研究表明在飼料中添加適量的維生素K3可以增強建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[22]消化酶活性和提高五龍鵝[23]的養(yǎng)分表觀消化率，但是飼料中維生素K3含量過高會引起松浦鏡鯉(CyprinuscarpioL.)[24]血清尿素氮含量升高。消化及代謝的改變或影響營養(yǎng)物質(zhì)在機體內(nèi)的沉積，水產(chǎn)動物的肌肉氨基酸和脂肪酸作為肉質(zhì)檢測的重要指標，其組成不僅影響著水產(chǎn)動物本身的生命活動，還對人體必需氨基酸和必需脂肪酸的攝入有著很大的影響。維生素K是否對水產(chǎn)動物機體中氨基酸和脂肪酸的含量和組成產(chǎn)生影響，尚未見相關(guān)報道。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)是一種淡水肉食性魚類，近年來，因其生長快、耐低溫、抗病性強、口感鮮美等優(yōu)點在我國廣受歡迎，2019年大口黑鱸的養(yǎng)殖總產(chǎn)量已達47.8萬t[25]。目前雖圍繞大口黑鱸營養(yǎng)素的需求量開展了大量的研究[26-34]，但未見有關(guān)維生素K的研究報道。已知維生素K的主要作用有促進凝血和骨骼發(fā)育，筆者前期也發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量的維生素K3可以提高大口黑鱸的生長性能、血液凝血能力、鈣含量和抗氧化能力[35]，但是是否會對其他生命過程造成影響還不明確。為此，本研究探究維生素K3對大口黑鱸幼魚消化能力、血清代謝指標、肌肉氨基酸和脂肪酸組成的影響，為大口黑鱸飼料配方的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

配制以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉和血粉為主要蛋白質(zhì)源、魚油和菜籽油為主要脂肪源的基礎(chǔ)飼料(表1)。為了控制維生素K3含量，在基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的亞硫酸煙酰胺甲萘醌(MNB，純度96.33%，由浙江某飼料開發(fā)有限公司提供)，同時減少沸石粉的用量，配制5種試驗飼料，使得飼料中維生素K3的含量分別為0.78(K0組)、5.80(K5組)、10.82(K10組)、15.84(K15組)和20.85 mg/kg(K20組)。根據(jù)GB 5009.158—2016和GB/T 18872—2017，通過高效液相色譜法測定K0組飼料中維生素K1和維生素K3的含量分別為53.2 μg/kg和0.78 mg/kg。通過反相高效液相色譜法沒有檢測出K0組飼料中的維生素K2含量[36]。以上各種維生素K的含量均委托河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司檢測。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

根據(jù)配方將各種原料稱重后粉碎，過60目篩網(wǎng)，然后與魚油、菜籽油和烏賊膏充分混勻，再加入水用制粒機制成顆粒料，在烘箱中40 ℃干燥12 h。干燥之后，將顆粒料儲存在陰涼、干燥、通風(fēng)良好的地方備用。

1.2 飼養(yǎng)管理

本試驗在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進行，試驗開始之前將水泥池和網(wǎng)箱進行消毒處理，每個水泥池內(nèi)放置4個網(wǎng)箱(長×寬×高=1.8 m×0.7 m×0.8 m)。試驗魚購自浙江省湖州市，經(jīng)過2周暫養(yǎng)適應(yīng)試驗條件，暫養(yǎng)期間使用購買的商品料進行投喂。在正式試驗開始前將暫養(yǎng)魚饑餓處理24 h，隨機挑選600尾體質(zhì)健康、規(guī)格均勻的大口黑鱸幼魚[初均重(12.96±0.07)g]隨機分成5組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)30尾，以重復(fù)為單位養(yǎng)殖于網(wǎng)箱。每天進行2次(08:00和16:00)表觀飽食投喂，持續(xù)8周，記錄每天的攝食量。當(dāng)有大口黑鱸死亡，及時將魚取出，計數(shù)并稱重。在飼養(yǎng)期間，養(yǎng)殖水體24 h充氣，不定期吸污、更換經(jīng)過曝氣的自來水，控制溶解氧濃度大于5 mg/L、氨氮含量小于0.5 mg/L、水溫28～31 ℃、pH 7.5～8.5。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，試驗魚饑餓24 h，每個重復(fù)隨機選取7尾魚，用1 mL注射器從尾靜脈處取血，儲存在離心管中，在4 ℃下靜置24 h后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min獲得的血清保存在-20 ℃條件下，用于血清代謝指標的分析。取出內(nèi)臟團后，剝離胃和腸道，并將腸道外圍的脂肪和腸道內(nèi)的殘余糞便清理干凈，用于消化酶活性的測定。取側(cè)線以上的肌肉冷凍干燥至恒重，粉碎并密封用于肌肉氨基酸和脂肪酸組成分析。之后，對剩余的大口黑鱸投喂含有三氧化二釔(Y2O3，0.1 mg/g)的飼料(相應(yīng)減少沸石粉的用量)，每天投喂1 h后采集糞便，持續(xù)2周，用于表觀消化率的測定。所有樣品均在-20 ℃條件下保存。

1.4 樣品分析

取胃和腸道稱重，置于0.85 %生理鹽水中冷凍勻漿(m/v=1∶4)，然后在4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液在12 h內(nèi)用于測定指標。血清解凍之后同樣也在12 h內(nèi)測定指標。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定胃和腸道的淀粉酶、脂肪酶活性和血清代謝指標，用福林法(GB/T 23527—2009)測定胃和腸道蛋白酶活性。以上指標均通過UV-3200紫外分光光度計測定。

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(GB 5009.268—2016)測定糞便中Y2O3的含量：將糞便經(jīng)冷凍干燥后使用微波消解法消解后，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，美國)測定糞便中Y2O3的含量。用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定糞便粗蛋白質(zhì)含量，用于表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率的計算。

采用酸水解法測定肌肉氨基酸組成：稱量肌肉干物質(zhì)，加6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃條件下水解24 h。水解完后，取1 mL水解液于進樣瓶中在氨基酸自動分析儀(S-433D，德國)上分析。

采用氯仿-甲醇法提取肌肉總脂，甲酯化后，使用氣相色譜儀(7890A，美國)聯(lián)合質(zhì)譜儀(5975A，美國)分析脂肪酸組，根據(jù)脂肪酸標準品的分析圖譜、保留時間以及質(zhì)譜分析對脂肪酸進行定性和定量分析。

1.5 計算公式

表觀消化率(%)=(1-飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)×100；粗蛋白質(zhì)表觀消化率(%)=[1-(糞便中粗蛋白質(zhì)含量×飼料中Y2O3含量)/(飼料中粗蛋白質(zhì)含量×糞便中Y2O3含量)]×100；必需氨基酸指數(shù)(EAAI)=(A/AE×B/BE×……×I/IE)(1/n)。

式中：n為必需氨基酸數(shù)量；A，B，…，I為大口黑鱸肌肉中必需氨基酸含量；AE，BE，…，IE為全雞蛋蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量[37]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行分析，以平均值±標準差(mean±SD)表示。當(dāng)方差分析確定組間差異顯著時，則用Duncan氏法進行多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸消化能力的影響

由表2可以看出，添加維生素K3的各組胃和腸道的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著低于未添加維生素K3的K0組(P<0.05)。K10組、K15組和K20組的表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率顯著低于K0組(P<0.05)。

表2 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸消化能力的影響Table 2 Effects of dietary vitamin K3 content on digestive ability of largemouth bass

2.2 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸血清代謝指標的影響

由表3可以看出，K20組血清尿素氮含量顯著高于其他4組(P<0.05)，5組間血清總蛋白、白蛋白、總膽固醇和甘油三酯含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸血清代謝指標的影響Table 3 Effects of dietary vitamin K3 content on serum metabolism indexes of largemouth bass

2.3 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸肌肉氨基酸和脂肪酸組成的影響

在大口黑鱸肌肉中共檢測出17種氨基酸，其中必需氨基酸9種，非必需氨基酸8種，色氨酸未檢測。由表4可知，必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量及必需氨基酸指數(shù)在各組之間無顯著差異(P>0.05)，但是隨著飼料中維生素K3含量的增加，必需氨基酸和總氨基酸含量呈增加的趨勢。K0組蘇氨酸、異亮氨酸和亮氨酸含量顯著低于其他4組(P<0.05)。

表4 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸肌肉氨基酸組成的影響(濕重基礎(chǔ))Table 4 Effects of dietary vitamin K3 content on amino acid composition of largemouth bass (wet weight basis) g/kg

在大口黑鱸肌肉中共檢測出15種脂肪酸，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪4種酸，多不飽和脂肪酸6種。由表5可以看出，K15組的單不飽和脂肪酸含量顯著高于其他4組(P<0.05)，其中C16∶1n7和C18∶1n5的含量均顯著高于其他4組(P<0.05)。飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量在各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸肌肉脂肪酸組成的影響(濕重基礎(chǔ)) Table 5 Effects of dietary vitamin K3 content on fatty acid composition of largemouth bass (wet weight basis) mg/g

續(xù)表5項目 Items組別 GroupsK0K5K10K15K20C18∶1n51.86±0.10a1.80±0.22a1.82±0.12a2.19±0.11b1.97±0.11aC18∶1n90.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.010.03±0.00C20∶1n70.05±0.000.05±0.010.05±0.000.06±0.000.06±0.00ΣMUFA 2.28±0.13a2.23±0.27a2.23±0.15a2.72±0.14b2.46±0.13aC18∶2n61.02±0.090.97±0.120.97±0.041.00±0.031.01±0.06C18∶3n30.10±0.010.09±0.020.09±0.010.09±0.010.10±0.00C20∶4n60.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.000.02±0.01C20∶5n30.04±0.000.04±0.010.04±0.000.04±0.000.04±0.01C22∶5n60.06±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.01C22∶6n30.77±0.080.75±0.160.72±0.010.81±0.130.71±0.04ΣPUFA 2.01±0.181.93±0.291.90±0.072.02±0.121.94±0.11

3 討 論

3.1 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸消化能力的影響

飼料利用效率取決于魚的消化和吸收能力[38]，消化能力與消化酶的活性密切相關(guān)，包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶[39]。已有研究表明，維生素K3能夠促進畜禽腸道蠕動和分泌，進而促進動物的消化吸收[40]，但是在水產(chǎn)動物中鮮有此方面的報道。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加維生素K3后，大口黑鱸的消化酶活性均顯著降低，表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率也有同樣的結(jié)果。但是Yuan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，適量的維生素K能夠顯著增強建鯉肝胰臟和腸道的消化酶活性，提高前腸的膽囊收縮素含量，并且認為消化酶活性的提高可能與膽囊收縮素有關(guān)。在大西洋鮭的研究中也發(fā)現(xiàn)膽囊收縮素能夠促進大西洋鮭胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌[41]。呂梅等[23]研究發(fā)現(xiàn)適量的維生素K3可以顯著提高五龍鵝的表觀消化率。Yuan等[22]還發(fā)現(xiàn)維生素K可能促進腸道的生長發(fā)育，提高腸道刷狀緣酶活性，提高建鯉的吸收能力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)添加維生素K3的試驗組腸體比顯著高于對照組[35]，推測維生素K3可以通過延長消化時間的方法幫助大口黑鱸吸收足夠的營養(yǎng)；相反，對照組的腸體比顯著低于試驗組，可能會導(dǎo)致魚體消化能力不足，需要通過其他途徑，如提高消化酶的活性，使機體的營養(yǎng)水平滿足生長發(fā)育的需求。但無論是改變腸長還是消化酶活性，添加維生素K3均降低了機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，這是否與機體的整體代謝率下降有關(guān)，還有待驗證。

3.2 飼料中維生素K3含量對大口黑鱸血清代謝指標的影響

肝臟是維生素K代謝的主要部位，維生素K的羧化作用是在肝臟中完成的。飼料中維生素K的含量可能會影響肝臟的消化、合成、儲存和解毒功能[24]。血清總蛋白、白蛋白和尿素氮含量是反映蛋白質(zhì)代謝的重要指標，血清中總蛋白和白蛋白含量低表明水生生物營養(yǎng)不良，蛋白質(zhì)代謝狀態(tài)不佳[42-43]。動物血清中90%～95%的蛋白質(zhì)在肝臟中合成，血清總蛋白含量可以作反映為動物肝臟合成蛋白質(zhì)能力的一個指標，當(dāng)肝功能嚴重受損時，蛋白質(zhì)的合成效率會降低，尤其是白蛋白。僅當(dāng)肝臟病變到一定程度之后，血清中的白蛋白含量才會出現(xiàn)顯著差異[44]。在本研究中，血清總蛋白和白蛋白含量在各組間無顯著差異，這一結(jié)果與王洋等[24]對松浦鏡鯉的研究結(jié)果一致。氨和尿素是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，大多數(shù)魚類是排氨動物，而形成尿素不僅有助于解除氨的毒性，還可以降低體內(nèi)由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的二氧化碳溶于血液所產(chǎn)生的酸性。本試驗中，K20組血清尿素氮含量顯著高于其他4組，可能是機體的一種自我保護機制，也可能是由尿素氮排泄不暢導(dǎo)致的。Chiou等[45]給小鼠注射高劑量的維生素K，當(dāng)注射量≥25 mg/kg時，小鼠腎臟出現(xiàn)顆粒變性的現(xiàn)象。當(dāng)飼料中維生素K3含量高達1 000～2 500 mg/kg，會對馬的腎臟造成損傷[46]。由此推測，飼料中維生素K3含量過高可能會引起大口黑鱸腎臟受損，從而導(dǎo)致血清尿素氮含量增加。王洋等[24]對松浦鏡鯉的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中維生素K3含量過高時，血清尿素氮含量顯著增加，是其他組含量的2～3倍。血清總膽固醇和甘油三酯是血清脂質(zhì)的重要成分，兩者都可以作為體內(nèi)脂質(zhì)代謝的指標。在本研究中，血清總膽固醇和甘油三酯含量各組間均無顯著差異，說明維生素K3對血脂代謝的影響較小，具體機制有待進一步研究。

3.3 飼料中添加維生素K3對大口黑鱸肌肉氨基酸和脂肪酸組成的影響

人體必須從食物中獲取賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等8種必需氨基酸，來滿足人體新陳代謝的需求[47]。在本研究中，大口黑鱸攝食添加不同水平維生素K3的飼料，肌肉蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量均顯著增加，更能滿足人體對這3種必需氨基酸的需求；與此同時，隨著飼料中維生素K3含量的增加，肌肉組氨酸、精氨酸和酪氨酸含量有降低的趨勢，但必需氨基酸和總氨基酸含量均有增長的趨勢，說明維生素K3對肌肉氨基酸組成有一定程度的改善效果；5組之間必需氨基酸指數(shù)沒有顯著差異，且均大于0.95[48]，說明大口黑鱸屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)食物。水產(chǎn)動物的肌肉富含脂肪酸，是人類獲取脂肪酸的重要來源。脂肪酸中的不飽和脂肪酸對人體的身體健康以及生理功能有著極為重要的作用[49]。在本研究中，投喂含有15.84 mg/kg維生素K3的飼料，可以有效促進大口黑鱸肌肉中C16∶1n7和C18∶1n5含量的提升。C16∶1n7可以幫助人體控制體重，改善皮膚狀況，預(yù)防動脈粥樣硬化等[50]，但是C18∶1n5可能會使心血管疾病的發(fā)病率增加[51]。C22∶6n3(DHA)具有輔助人體腦細胞發(fā)育、改善血液循環(huán)等功能，雖然其含量在各組間無顯著差異，但是K15組的肌肉DHA含量高于其他組。綜上所述，飼料中添加適量的維生素K3對于大口黑鱸的肌肉氨基酸組成具有積極的改善作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素K3的各試驗組大口黑鱸的終末體重(44.01～47.46 g)均大于對照組(43.37 g)[35]；對草魚的研究也得出了類似的結(jié)果[52-54]。上述結(jié)果表明肌肉氨基酸組成與體重有關(guān)，也間接證明氨基酸在促進魚體生長方面發(fā)揮著重要作用。不過，關(guān)于維生素K3對大口黑鱸氨基酸和脂肪酸組成影響的具體機制還不明確。

4 結(jié) 論

飼料中添加維生素K3對大口黑鱸的肌肉氨基酸組成具有積極的改善效果，當(dāng)飼料中維生素K3含量≥5.80 mg/kg時使大口黑鱸的消化能力下降，并且高劑量的維生素K3會使蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相關(guān)代謝發(fā)生改變。