劉立山 周 瑞 吳建平* 郎 俠 王彩蓮

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅省牛羊種質(zhì)與秸稈飼料化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070)

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展，開發(fā)安全可靠的抗生素天然替代物成為當(dāng)今飼料添加劑研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來，天然活性物飼料添加劑的開發(fā)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[1]。植物精油作為天然抗生素替代品，已經(jīng)作為飼料添加劑用于改善飼料利用率以及動(dòng)物健康，受到業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注。很多生產(chǎn)者期望通過應(yīng)用植物精油產(chǎn)品直接抑制病原菌來替代飼用抗生素，然而植物精油由于其成分復(fù)雜多樣，對(duì)其功能性物質(zhì)的影響較大，因此關(guān)于植物精油作用機(jī)理的研究比較困難。研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加香芹酚可以降低大腸桿菌的數(shù)量，提高乳桿菌的數(shù)量[2]，添加百里香酚可以降低肉雞腸道中大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，減輕腸道損傷[3]。在荷斯坦奶牛飼糧中添加牛至精油(有效成分為香芹酚和百里香酚)能夠使奶牛乳房炎發(fā)病率降低2%，腹瀉發(fā)病率降低10%[4]，還能顯著提高犢牛的體尺、日采食量和日增重[5]，并且可以改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，顯著提高瘤胃中纖維素酶和胃蛋白酶的活性[6]。由于目前大量的研究主要集中在植物精油的開發(fā)與應(yīng)用，然而植物精油中的化學(xué)成分眾多，有效組分復(fù)雜。就香芹酚和百里香酚而言，有研究表明其可以刺激肉雞消化液的分泌，提高內(nèi)源消化酶的活性，增強(qiáng)腸道的消化吸收功能[7]，但是對(duì)反芻動(dòng)物是否具有相同的功能，目前還未見報(bào)道。本試驗(yàn)選擇香芹酚和百里香酚為研究對(duì)象，分析其作為飼料添加劑對(duì)綿羊養(yǎng)分表觀消化率、瘤胃發(fā)酵特性及纖維降解菌數(shù)量的影響，以期為今后的抗生素替代產(chǎn)品的開發(fā)與選擇提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

選取9只1歲左右的健康且體況和體重[(56.68±3.14) kg]相近裝有永久瘤胃瘺管的小尾寒羊公羊，單籠飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2007)60 kg生長公羊日增重為250 g/d時(shí)的營養(yǎng)需要配制，精粗比為37.5∶62.5，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧每天分2次(07:00和19:00)等量飼喂，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content鈣 Ca 0.41磷 P0.27

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

將9只瘺管羊隨機(jī)分為3組，采用3個(gè)重復(fù)的3×3拉丁方設(shè)計(jì)，進(jìn)行3期飼養(yǎng)試驗(yàn)。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)1組(T1組)在基礎(chǔ)飼糧精料中添加2 g/d香芹酚(香芹酚純度為87.5%)，試驗(yàn)2組(T2組)在基礎(chǔ)飼糧精料中添加2 g/d百里香酚(百里香酚純度為93.6%)。每期20 d，預(yù)試期5 d，正試期15 d。從正試期第10天開始，連續(xù)5 d采用全收糞法進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)，記錄采食量和排糞量，測定養(yǎng)分表觀消化率；正試期最后1天在采食前(0 h)以及采食后1、3、5、7 h采集瘤胃液，立即用HI98103型筆式酸度計(jì)(北京泰亞賽福有限公司)測定瘤胃液pH；瘤胃液經(jīng)4層滅菌紗布過濾，濾液裝于經(jīng)高壓滅菌的采樣管內(nèi)，-20 ℃保存，用于測定發(fā)酵參數(shù)。

1.3 測定指標(biāo)及測定方法

1.3.1 表觀消化率測定

消化試驗(yàn)期間，每天采集少量精料和粗料，按飼喂比例混合均勻，粉碎通過0.45 mm篩，測定飼糧中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量。將采集的糞樣在65 ℃烘干，回潮24 h后測定初水分，粉碎通過0.45 mm篩，分析糞樣中DM、CP、NDF和ADF的含量。飼糧及糞樣中的養(yǎng)分測定參照張麗英[8]的方法進(jìn)行。養(yǎng)分表觀消化率計(jì)算公式如下：

干物質(zhì)表觀消化率(DMD)=(飼糧干物質(zhì)攝入量-糞便干物質(zhì)排放量)/飼糧干物質(zhì)攝入量；粗蛋白質(zhì)表觀消化率(CPD)=100×(飼糧粗蛋白質(zhì)攝入量-糞便粗蛋白排放量)/飼糧粗蛋白質(zhì)攝入量；中性洗滌纖維表觀消化率(NDFD)=100×(飼糧中性洗滌纖維攝入量-糞便中性洗滌纖維排放量)/飼糧中性洗滌纖維攝入量；酸性洗滌纖維表觀消化率(ADFD)=100×(飼糧酸性洗滌纖維攝入量-糞便酸性洗滌纖維排放量)/飼糧酸性洗滌纖維攝入量。

1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

瘤胃液pH用HI98103型筆式酸度計(jì)(北京泰亞賽福有限公司)測定；氨態(tài)氮(NH3-N)濃度使用苯酚-次氯酸鈉比色法[9]測定；微生物蛋白(MCP)濃度采用試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))測定；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度參照文獻(xiàn)[10]的方法采用氣相色譜儀(GC-2010 Plus，島津，日本)測定。

1.3.3 瘤胃纖維降解菌數(shù)量測定

瘤胃微生物特異性引物見表2，白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的引物參照周瑞等[11]，黃色瘤胃球菌的引物參照Koike等[12]。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。

表2 瘤胃微生物qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR of rumen microorganisms

微生物總DNA的提取利用天根(北京)糞樣DNA提取試劑盒進(jìn)行。微生物數(shù)量利用Light Cycler?480 Ⅱ型熒光定量基因擴(kuò)增儀采用熒光定量PCR(qPCR)比較閾值法進(jìn)行測定。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)參照Roche試劑盒(Gat.No.06402712001)說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：Master Mix 10 μL，模板2 μL(20 ng)，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。目的菌數(shù)量以每個(gè)樣品中每毫升16S rRNA或18S rRNA基因拷貝數(shù)(拷貝數(shù)/mL)表示[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的one-way ANOVA和GLM程序進(jìn)行方差分析，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊養(yǎng)分表觀消化率的影響

香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊養(yǎng)分表觀消化率的影響見表3。結(jié)果顯示，3組間試驗(yàn)羊的采食量無顯著差異(P>0.05)，但CON組的排糞量顯著高于其他2組(P<0.05)。T1組的DMD、CPD顯著高于CON組(P<0.05)，T2組的DMD、CPD與CON組無顯著差異(P>0.05)。各組間NDFD、ADFD無顯著差異(P>0.05)。

表3 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 3 Effects of carvacrol and thymol on nutrient apparent digestibility of sheep

2.2 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N濃度的影響見表4。結(jié)果顯示，隨著采食后時(shí)間的延長，瘤胃液pH先降低后升高。采食后1、3 h時(shí)，T1組pH顯著低于CON組(P<0.05)；采食后3 h時(shí)，T1、T2組pH與CON組相比無顯著變化(P>0.05)；采食后5、7 h時(shí)，T1組pH顯著低于T2組(P<0.05)。采食后0、1 h時(shí)，T1、T2組MCP濃度顯著高于CON組(P<0.05)；采食后3、7 h時(shí)，T1組MCP濃度顯著高于其他2組(P<0.05)；采食后5 h時(shí)，T1組MCP濃度顯著高于CON組(P<0.05)，但與T2組無顯著差異(P>0.05)。采食后1 h時(shí)，T1組NH3-N濃度顯著高于CON組(P<0.05)，CON組NH3-N濃度顯著高于T2組(P<0.05)；采食后3、7 h時(shí)，CON組NH3-N濃度顯著高于其他2組(P<0.05)。從平均值看，T1組pH顯著低于其他2組(P<0.05)，MCP濃度顯著高于其他2組(P<0.05)，NH3-N濃度顯著低于CON組(P<0.05)。

表4 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N濃度的影響Table 4 Effects of carvacrol and thymol on pH, MCP and NH3-N concentrations in rumen fluid of sheep

2.3 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液VFA組成的影響

香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液VFA濃度的影響見表5。結(jié)果顯示，隨著采食后時(shí)間的延長，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸比例先升高后降低。采食后0、1、3、5 h時(shí)，CON組TVFA濃度顯著低于T1、T2組(P<0.05)；采食后7 h時(shí)，CON、T1、T2組TVFA濃度無顯著差異(P>0.05)。采食后1、3 h時(shí)，T2組乙酸比例顯著高于CON組(P<0.05)，而在采食后7 h時(shí)，T2組乙酸比例顯著低于CON組(P<0.05)。采食后3 h時(shí)，T1組丙酸比例顯著低于CON組(P<0.05)；采食后5 h時(shí)，T1組丙酸比例顯著高于其他2組(P<0.05)。采食后0、1 h時(shí)，T2組丁酸比例顯著低于T1、CON組(P<0.05)；采食后3 h時(shí)，T1組丁酸比例顯著低于T2、CON組(P<0.05)；采食后5 h時(shí)，CON組丁酸比例顯著高于T1、T2組(P<0.05)。采食后0、1、7 h時(shí)，CON、T1、T2組乙酸/丙酸值無顯著差異(P>0.05)；采食后3 h時(shí)，T1組乙酸/丙酸值顯著高于CON組(P<0.05)，與T2組無顯著差異(P>0.05)；采食后5 h時(shí)，CON組乙酸/丙酸值顯著高于T1、T2組(P<0.05)，T1組乙酸/丙酸值最低(3.50)。從平均值看，T1、T2組TVFA濃度均顯著高于CON組(P<0.05)，T2組丁酸比例顯著低于其他2組(P<0.05)，乙酸比例、乙酸/丙酸值各組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液VFA組成的影響Table 5 Effects of carvacrol and thymol on VFA composition in rumen fluid of sheep

2.4 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液纖維降解菌數(shù)量的影響

香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液纖維降解菌數(shù)量的影響見表6。結(jié)果顯示，采食后不同時(shí)間瘤胃液纖維降解菌數(shù)量變化各異。采食后1、5 h時(shí)，CON組黃色瘤胃球菌數(shù)量顯著低于T1組(P<0.05)；采食后3 h時(shí)，CON組黃色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于T2組(P<0.05)。采食后0、1、3 h時(shí)，CON和T1組白色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于T2組(P<0.05)；采食后5、7 h時(shí)，CON組白色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于T1組(P<0.05)。采食后0、1、3、5 h時(shí)，CON組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著低于T1組(P<0.05)，與T2組無顯著差異(P>0.05)；采食后7 h時(shí)，T1組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于T2組(P<0.05)，與CON組無顯著差異(P>0.05)。從平均值來看，T1組黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量均顯著高于CON和T2組(P<0.05)，CON組白色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于T1和T2組(P<0.05)。

表6 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響Table 6 Effects of carvacrol and thymol on cellulose-decomposed bacteria counts in rumen fluid of sheep

3 討 論

3.1 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊養(yǎng)分表觀消化率的影響

養(yǎng)分表觀消化率是反映飼糧中養(yǎng)分被動(dòng)物消化利用的難易程度。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加香芹酚能夠提高肉雞腸道干物質(zhì)消化率[14]。在綿羊飼糧中添加以香芹酚和百里香酚為主要活性組分的牛至精油后，顯著提高了瘤胃中脂肪酶活性和瓣胃中纖維素酶活性[6]。在體外產(chǎn)氣試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)牛至精油能夠提高飼糧養(yǎng)分降解率，調(diào)控瘤胃發(fā)酵，降低總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加香芹酚可以顯著提高綿羊的DMD、CPD，但對(duì)NDFD、ADFD無顯著影響，這可能是因?yàn)橄闱鄯涌梢哉{(diào)控胃腸道中的微生物群落，提高消化酶活性，有利于促進(jìn)微生物對(duì)飼糧的消化。研究發(fā)現(xiàn)牛至精油可以促進(jìn)MCP的合成[16]，結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，香芹酚顯著提高CPD，而百里香酚對(duì)CPD無顯著影響，可以推斷出牛至精油中對(duì)蛋白質(zhì)消化起主要作用的活性組分應(yīng)該是香芹酚，其在促進(jìn)蛋白質(zhì)消化的同時(shí)加速了氮源的循環(huán)利用，有利于微生物對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)的降解利用，為動(dòng)物機(jī)體提供充足的氮源，這也是CPD升高的原因之一。本研究中百里香酚對(duì)綿羊各養(yǎng)分表觀消化率無顯著影響，這也說明在本試驗(yàn)條件下，香芹酚更有利于促進(jìn)綿羊?qū)︼暭Z干物質(zhì)、蛋白質(zhì)的消化吸收。目前香芹酚和百里香酚單一組分在反芻動(dòng)物上的研究較少，促進(jìn)反芻動(dòng)物養(yǎng)分消化的作用機(jī)理還需進(jìn)一步深化研究。

3.2 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

瘤胃液pH是瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的反映指標(biāo)，主要受飼糧、唾液和發(fā)酵產(chǎn)物的影響[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著采食后時(shí)間的延長，瘤胃液pH先降低后升高。采食后，由于瘤胃內(nèi)VFA等代謝產(chǎn)物的積累，pH逐漸降低，隨著機(jī)體對(duì)這些代謝產(chǎn)物的不斷吸收，pH將逐漸上升，這與本研究中瘤胃液TVFA濃度的變化規(guī)律相符。微生物利用氮源合成MCP，為反芻動(dòng)物提供蛋白質(zhì)來源。適宜的NH3-N濃度有利于增強(qiáng)瘤胃微生物活性，而NH3-N濃度過高會(huì)造成養(yǎng)分浪費(fèi)，過低會(huì)降低瘤胃微生物活性[17]。瘤胃液NH3-N濃度降低意味著瘤胃中蛋白質(zhì)降解率的降低或者瘤胃微生物對(duì)NH3-N利用率的提高。本研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃發(fā)酵過程中，香芹酚和百里香酚均可以顯著提高瘤胃液MCP濃度，降低瘤胃液NH3-N濃度。但是，在發(fā)酵的不同時(shí)間內(nèi)，香芹酚和百里香酚對(duì)瘤胃液MCP和NH3-N濃度的影響不同。采食后，由于食物充足，香芹酚可以促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，營養(yǎng)成分快速降解，瘤胃液pH迅速降低，NH3-N濃度相應(yīng)升高，同時(shí)為微生物提供了充足的氮源，微生物利用大量的氮源合成MCP，因此發(fā)酵后期MCP濃度升高，NH3-N濃度逐漸降低。香芹酚和百里香酚都是牛至精油的主要活性成分，已經(jīng)證實(shí)牛至精油有利于飼糧養(yǎng)分的降解，降低瘤胃液NH3-N濃度，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵[15]。這也表明，香芹酚和百里香酚混合使用和單獨(dú)使用對(duì)瘤胃發(fā)酵都具有調(diào)控作用。

3.3 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液VFA組成的影響

飼糧中的碳水化合物通過瘤胃微生物的代謝作用，最終形成VFA，VFA是反芻動(dòng)物主要的能量來源以及合成乳脂和體脂的重要原料[18]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加香芹酚和百里香酚使得瘤胃液TVFA濃度升高，這主要與香芹酚和百里香酚的理化性質(zhì)有關(guān)，瘤胃中VFA濃度主要受飼糧組成成分的影響[19]，但是對(duì)于組成成分相同的飼糧而言，瘤胃液中VFA濃度主要受瘤胃中微生物的種類和數(shù)量的影響，VFA是瘤胃微生物發(fā)酵的終產(chǎn)物，是供應(yīng)反芻動(dòng)物能量代謝的主要形式。本試驗(yàn)結(jié)果表明，香芹酚和百里香酚均可促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，可能是由于香芹酚和百里香酚可以調(diào)控瘤胃微生物，使得微生物發(fā)酵產(chǎn)生更多VFA，這有利于為動(dòng)物生產(chǎn)提供更多能量，與瘤胃液中纖維素降解菌數(shù)量的變化相吻合。與此同時(shí)，瘤胃液乙酸/丙酸值在試驗(yàn)中無顯著差異，這也表明香芹酚和百里香酚的添加只是促進(jìn)了瘤胃的發(fā)酵程度，并沒有改變瘤胃發(fā)酵類型，從數(shù)據(jù)來看，依然是以乙酸發(fā)酵為主。

3.4 香芹酚和百里香酚對(duì)綿羊瘤胃液纖維降解菌數(shù)量的影響

反芻動(dòng)物所需營養(yǎng)主要來源于瘤胃微生物對(duì)飼糧中碳水化合物的發(fā)酵。香芹酚和百里香酚能加速胃腸道上皮細(xì)胞的更新率，減少病原體對(duì)腸道上皮細(xì)胞的感染，抑制有害菌的生長[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚可以提高綿羊瘤胃液黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量，同時(shí)降低了白色瘤胃球菌數(shù)量；百里香酚可以降低綿羊瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量，對(duì)其他2種纖維降解菌數(shù)量無顯著影響。黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃中主要的纖維降解菌[21]，纖維降解菌數(shù)量升高加速了對(duì)碳水化合物的降解利用。香芹酚和百里香酚對(duì)纖維降解菌的影響各異，這可能與自身的理化性質(zhì)有關(guān)。香芹酚在顯著降低瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量的同時(shí)，顯著升高黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量，這有可能是由于白色瘤胃球菌和其他2種纖維降解菌存在競爭的關(guān)系，白色瘤胃球菌數(shù)量的降低使得其他2種纖維降解菌活性增強(qiáng)，同時(shí)可以獲取更多的氮源來合成MCP，這與前文中MCP濃度顯著升高的結(jié)論相一致。另外，結(jié)合前文中養(yǎng)分表觀消化率的結(jié)果可以推斷，纖維降解菌數(shù)量的升高并不能直接導(dǎo)致飼糧纖維消化率的提高，影響飼糧纖維消化率的因素復(fù)雜多變，飼糧纖維消化率受動(dòng)物品種和生理階段、飼糧組成和結(jié)構(gòu)、流通速度等諸多因素的影響[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加牛至精油可以顯著增加黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量[23]。牛至精油主要有效成分為香芹酚和百里香酚等物質(zhì)，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果可以推斷，混合植物精油對(duì)瘤胃微生物的活性作用優(yōu)于單一成分的植物精油，香芹酚和百里香酚之間可能存在一定的協(xié)同效應(yīng)，這可能也是有本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果有所差異的主要原因。

4 結(jié) 論

① 香芹酚可顯著提高綿羊的DMD和CPD，促進(jìn)養(yǎng)分的消化和吸收。

② 香芹酚、百里香酚均可顯著提高綿羊瘤胃液TVFA濃度，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。

③ 香芹酚、百里香氛均可顯著降低綿羊瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量，香芹酚還可顯著提高綿羊瘤胃液黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量，調(diào)控瘤胃纖維降解菌數(shù)量。