王鑫鑫 李茜茜 呂 毅 馬文鋒 武曉紅 趙芙蓉

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

豆粕是動(dòng)物飼糧中蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。我國(guó)是蛋白質(zhì)資源相對(duì)短缺的國(guó)家，豆粕的對(duì)外依存度也隨著畜牧業(yè)的發(fā)展大大增加，2017年我國(guó)大豆進(jìn)口量高達(dá)9 554萬(wàn)t。同時(shí)，我國(guó)肉雞養(yǎng)殖主要是以玉米-豆粕型飼糧為代表的高蛋白質(zhì)飼糧，這雖然保證了肉仔雞快速生長(zhǎng)，但也造成了氮的過(guò)量排放和蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。因此，如何合理利用蛋白質(zhì)、減少資源浪費(fèi)成為研究的熱點(diǎn)[1]。在畜禽養(yǎng)殖中，動(dòng)物自身不能完全消化飼糧中的蛋白質(zhì)，而未消化的蛋白質(zhì)會(huì)作為單胃動(dòng)物腸道微生物的發(fā)酵底物導(dǎo)致動(dòng)物消化紊亂[2]。研究表明，蛋白酶作為飼料添加劑可以有效地提高飼糧蛋白質(zhì)的利用效率，從而改善動(dòng)物采食[3]。外源蛋白酶可以補(bǔ)充幼齡動(dòng)物內(nèi)源酶分泌的不足，提高蛋白質(zhì)的消化吸收，降低腸道吸收蛋白質(zhì)的壓力[4]。蛋白質(zhì)水平對(duì)雞的采食行為有著重要的影響[5]。研究還表明，蛋白酶對(duì)雞的血液生化指標(biāo)存在顯著影響[6-7]。除此之外，侯振平等[8]研究表明，蛋白酶對(duì)動(dòng)物的腸道健康存在積極影響，可以改善雞的腸道形態(tài)。由此可見(jiàn)，蛋白酶可以提高動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，提高蛋白質(zhì)利用率，對(duì)肉雞福利起到積極作用的同時(shí)避免蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證組合蛋白酶在肉雞飼糧中的添加效果，本試驗(yàn)以愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞作為研究對(duì)象，探討組合蛋白酶對(duì)肉仔雞采食偏好性、血清生化指標(biāo)和腸道組織形態(tài)的影響，從而為組合蛋白酶的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用組合蛋白酶從市場(chǎng)上購(gòu)得，為堿性蛋白酶，呈粉狀固體，酶活性為251 852 U/g。試驗(yàn)采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)1

選擇1日齡體況相近、健康的AA肉仔雞40只，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理10只雞，每個(gè)處理的肉雞單獨(dú)飼養(yǎng)于同一籠中。采用自由選擇試驗(yàn)法，同時(shí)為4個(gè)處理的肉雞飼喂基礎(chǔ)飼糧(飼糧Ⅰ)以及在基礎(chǔ)飼糧中分別添加4(飼糧Ⅱ)、8(飼糧Ⅲ)和12 U/g(飼糧Ⅳ)組合蛋白酶的飼糧。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，試驗(yàn)期42 d。

1.2.2 試驗(yàn)2

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇1日齡體況相近、健康的AA肉仔雞240只，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組(Ⅰ組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(Ⅱ～Ⅳ組)分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加4、8和12 U/g組合蛋白酶的飼糧。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，試驗(yàn)期42 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在河南科技大學(xué)牧場(chǎng)進(jìn)行，肉仔雞均飼養(yǎng)在規(guī)格相同的籠內(nèi)，飼養(yǎng)密度為10 只/m2。人工控制舍內(nèi)溫度，仔雞1～3日齡時(shí)，舍內(nèi)溫度控制不低于35 ℃；4～7日齡時(shí)舍內(nèi)溫度控制在32～33 ℃；自第2周開(kāi)始，每周降低3 ℃左右，直至保持在22～24 ℃為止。同時(shí)，保證舍內(nèi)相對(duì)濕度維持在50%左右。雞舍采用16 h光照和8 h黑暗的光照制度，自然通風(fēng)與機(jī)械通風(fēng)相結(jié)合，定期打掃雞舍衛(wèi)生[9]。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 采食偏好性

試驗(yàn)1中，試驗(yàn)雞于每周的最后1天測(cè)定飼糧的耗料量，同時(shí)使用小蟻智能攝像機(jī)(夜視版)對(duì)其進(jìn)行24 h連續(xù)拍攝記錄，試驗(yàn)錄像在計(jì)算機(jī)上轉(zhuǎn)換后使用The Observer XT 12行為分析軟件(Noldus，荷蘭)進(jìn)行連續(xù)采樣和瞬時(shí)采樣分析。采用連續(xù)采樣法分析肉仔雞對(duì)4種飼糧的采食行為發(fā)生的總采食時(shí)間、每頓采食時(shí)間以及采食次數(shù)；采用瞬時(shí)采樣法，每隔30 min進(jìn)行1次采樣，分析每種飼糧的采食雞只數(shù)，計(jì)算4種飼糧的采食百分比。

1.4.2 血清生化指標(biāo)

試驗(yàn)2中，于21和42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只雞，采用翅下靜脈采血法進(jìn)行采血，每只雞采5 mL，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀(東芝TBA-2000FR，日本)測(cè)定血清中葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)活性。

1.4.3 腸道組織形態(tài)

于試驗(yàn)第42天09:00開(kāi)始，從試驗(yàn)2每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只試驗(yàn)雞進(jìn)行屠宰，打開(kāi)腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，每段腸段取2 cm，用生理鹽水沖掉內(nèi)容物，浸入4%的多聚甲醛溶液中常溫保存，以制備石蠟切片。腸道組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片和蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察拍照，使用Case Viewer軟件分析測(cè)量小腸絨毛高度和隱窩深度并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2016初步統(tǒng)計(jì)后，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞采食偏好性的影響

由表2可知，1～21日齡，各處理肉仔雞對(duì)不同飼糧的耗料量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；與飼糧Ⅰ相比，肉仔雞對(duì)飼糧Ⅱ、飼糧Ⅲ和飼糧Ⅳ的采食次數(shù)、總采食時(shí)間和每頓采食時(shí)間也均無(wú)顯著差異(P>0.05)。22～42日齡，雖然耗料量隨著肉仔雞的生長(zhǎng)而增加，各處理肉仔雞對(duì)不同飼糧的耗料量之間仍無(wú)顯著差異(P>0.05)；且與飼糧Ⅰ相比，肉仔雞對(duì)飼糧Ⅱ、飼糧Ⅲ和飼糧Ⅳ的采食次數(shù)、總采食時(shí)間和每頓采食時(shí)間也均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞采食偏好性的影響Table 2 Effects of combinatorial protease on feed intake preference of broilers

續(xù)表2項(xiàng)目 Items飼糧 DietsⅠⅡⅢⅣ總采食時(shí)間 Total feed intake time/[min/(只·d)]105.56±12.48115.78±14.42105.72±18.07106.89±13.1322～42日齡 22 to 42 days of age耗料量 Feed consumption/[g/(只·d)]192.22±41.01202.22±36.50213.89±41.21207.22±37.68采食次數(shù) Feed intake times/[次/(只·d)]8.67±0.978.33±0.978.44±0.988.28±0.89每頓采食時(shí)間 Feed intake time per meal/[min/(只·d)]18.87±2.8019.67±2.6619.42±2.7919.79±2.26總采食時(shí)間 Total feed intake time/[min/(只·d)]110.17±16.39116.06±15.67107.78±15.48112.39±12.83

由圖1可知，1～21日齡，各處理肉仔雞對(duì)4種飼糧的采食百分比分別為23.4%、23.4%、25.3%和27.9%，各處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)。22～42日齡，各處理肉仔雞對(duì)4種飼糧的采食百分比分別為22.6%、32.1%、23.3%和22.0%，其中處理Ⅱ的采食百分比顯著高于其他3個(gè)處理(P<0.05)。1～42日齡，各處理肉仔雞對(duì)4種飼糧的采食百分比之間雖無(wú)顯著差異(P>0.05)，但處理Ⅱ達(dá)到27.8%，比處理Ⅰ、處理Ⅲ和處理Ⅳ更高(分別為23.0%、24.3%和24.9%)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。Data columns with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞采食百分比的影響Fig.1 Effects of combinatorial protease on feed intake percentage of broilers

2.2 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，21日齡時(shí)，各組肉仔雞血清ALB、T3和T4含量以及ALT、AST和ALP活性之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；Ⅳ組血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量最高，其中血清TP、GLB和HDL-C含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，血清TC和LDL-C顯著高于其他各組(P<0.05)；Ⅰ組血清GLU含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表3 組合蛋白酶對(duì)21日齡肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 21 days of age

由表4可知，42日齡時(shí)，各組肉仔雞血清GLU、ALB、TC、TG、HDL-C、LDL-C和T3含量以及ALT、AST和ALP活性之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；Ⅲ組血清TP和GLB含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；Ⅲ組血清T4含量最低，顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。

表4 組合蛋白酶對(duì)42日齡肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 42 days of age

2.3 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

由表5可知，Ⅱ組和Ⅲ組肉仔雞回腸絨毛高度顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅲ組回腸隱窩深度最低，顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；各組回腸V/C值無(wú)顯著差異(P>0.05)。Ⅲ組和Ⅳ組肉仔雞空腸隱窩深度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，空腸V/C值也顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。Ⅱ組肉仔雞十二指腸隱窩深度最低，但與Ⅰ組相比差異不顯著(P>0.05)；Ⅱ組十二指腸V/C值最高，顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P<0.05)。

表5 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響Table 5 Effects of combinatorial protease on intestinal tissue morphology of broilers

3 討 論

3.1 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞采食偏好性的影響

食物偏好是指有多種食物可選擇時(shí)，動(dòng)物更多地選擇某一種食物，如虎、獅等在捕獲獵物后，大都先獵食動(dòng)物的內(nèi)臟。動(dòng)物對(duì)各種飼糧的選擇和采食行為反映著動(dòng)物的食物偏好，即采食偏好。研究表明，飼糧蛋白質(zhì)水平會(huì)對(duì)肉仔雞采食行為產(chǎn)生影響，隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的提高，肉仔雞采食行為占比顯著降低，趴臥行為占比顯著提高[5，10]。蛋白酶具有提高蛋白質(zhì)利用率的作用，然而本研究中各處理肉仔雞對(duì)不同飼糧在耗料量、采食次數(shù)、每頓采食時(shí)間及總采食時(shí)間上均未表現(xiàn)出顯著差異，這與其他研究結(jié)果不同。產(chǎn)生這種不同的原因可能是本試驗(yàn)為肉仔雞提供了高蛋白質(zhì)飼糧，無(wú)法體現(xiàn)出動(dòng)物在缺乏蛋白質(zhì)狀態(tài)下的表現(xiàn)。而本研究中，肉仔雞生長(zhǎng)后期(22～42日齡)采食添加4 U/g組合蛋白酶飼糧的采食百分比顯著高于其他飼糧，明顯表現(xiàn)出對(duì)該飼糧的偏好，產(chǎn)生這種差別的原因可能是肉仔雞不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)飼糧的偏好不同，具體原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

3.2 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響

動(dòng)物機(jī)體血液生化指標(biāo)的變化是反映動(dòng)物代謝的直觀表現(xiàn)[11-12]。血液中的GLU、TP和ALB是反映機(jī)體蛋白質(zhì)利用率的重要指標(biāo)，GLB是反映機(jī)體免疫的重要指標(biāo)，TC和TG是機(jī)體脂類(lèi)代謝的重要指標(biāo)；ALT和AST參與脂類(lèi)和蛋白質(zhì)代謝，是反映肝臟和心臟功能的重要指標(biāo)[13-16]。侯振平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蛋白酶對(duì)21日齡肉仔雞血清GLU、TP、ALB、GLB、TC和TG含量均無(wú)顯著影響。本研究中，飼糧添加組合蛋白酶對(duì)21日齡肉仔雞血清ALB含量無(wú)顯著影響，這與上述研究結(jié)果一致；但飼糧添加組合蛋白酶對(duì)21日齡肉仔雞血清GLU、TP、GLB、TC和TG均表現(xiàn)出顯著影響，其中Ⅳ組血清TP、GLB和TC含量顯著高于Ⅰ組，原因可能是高劑量的組合蛋白酶更有利于水解蛋白質(zhì)，從而提高蛋白質(zhì)利用率。42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞血清GLU、ALB、TC和TG含量等與對(duì)照相相比均無(wú)顯著差異，可能是由于隨著肉仔雞的生長(zhǎng)發(fā)育，組合蛋白酶對(duì)其吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響逐漸降低。李東東[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質(zhì)水平飼糧添加外源蛋白酶對(duì)肉仔雞血清ALT和AST活性無(wú)顯著影響，本研究與之結(jié)果一致。T3和T4統(tǒng)稱(chēng)為甲狀腺激素，可以有效反映機(jī)體的代謝變化和應(yīng)激程度，以此反映動(dòng)物福利狀況[18]。本試驗(yàn)中，21日齡時(shí)，飼糧添加組合蛋白酶對(duì)肉仔雞血清T3和T4含量無(wú)顯著影響；42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，Ⅲ組血清T4含量雖然顯著降低，但血清T3含量無(wú)顯著差異，而T4在外周血液中，只有轉(zhuǎn)化成T3才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因此組合蛋白酶對(duì)肉仔雞機(jī)體代謝和應(yīng)激并未產(chǎn)生顯著影響。

3.3 組合蛋白酶對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

腸道是吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官之一，小腸絨毛是吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。小腸結(jié)構(gòu)和功能的完整性影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，其中小腸絨毛高度和隱窩深度與腸道生理相關(guān)，也是衡量腸道功能的重要指標(biāo)[19]。小腸絨毛高度與吸收效率有關(guān)，絨毛高度增加會(huì)增加腸黏膜與食糜接觸的表面積，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；隱窩深度反映了細(xì)胞增殖的速率，隱窩深度變淺表明腸道上皮細(xì)胞成熟率上升，腸黏膜上皮絨毛吸收能力增強(qiáng)[20]；而V/C值可以用來(lái)反映腸道吸收效率，V/C值升高則腸道吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速率加快，反之則降低。

研究表明，適量酶制劑能提高肉仔雞小腸絨毛高度，過(guò)量反而不利于肉仔雞腸道發(fā)育[21-23]。本研究中，Ⅱ組肉仔雞空腸和十二指腸隱窩深度顯著低于Ⅲ組，空腸和十二指腸V/C值顯著高于Ⅲ組；Ⅳ組空腸隱窩深度顯著高于Ⅰ組，空腸V/C值顯著低于Ⅰ組。以上結(jié)果表明，在飼糧中添加適量的組合蛋白酶有利于改善肉仔雞腸道組織形態(tài)，過(guò)量的蛋白酶反而不利于腸道發(fā)育，這與周梁[22]的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，在飼糧中添加適量的組合蛋白酶有利于改善肉仔雞腸道組織形態(tài)。不過(guò)，本研究中，Ⅰ組肉仔雞回腸絨毛高度顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組，組合蛋白酶反而抑制了回腸絨毛高度，這可能與蛋白酶到達(dá)回腸時(shí)活性降低有關(guān)。關(guān)于組合蛋白酶的最適添加量及其影響機(jī)制仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

① 肉仔雞僅在其生長(zhǎng)后期(22～42日齡)對(duì)添加4 U/g組合蛋白酶的飼糧表現(xiàn)出采食偏好性。

② 飼糧添加12 U/g組合蛋白酶顯著提高了21日齡肉仔雞血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量，改善了機(jī)體脂類(lèi)合成，增強(qiáng)了肉仔雞免疫力；飼糧添加8 U/g組合蛋白酶顯著提高了42日齡肉仔雞血清TP和GLB含量。

③ 飼糧添加4 U/g組合蛋白酶可以提高或維持肉仔雞十二指腸和空腸V/C值，改善肉仔雞腸道組織形態(tài)。

④ 綜合考量，本試驗(yàn)中組合蛋白酶的適宜添加量為8 U/g。