汪昭睿 王雪瑩 解偉純 宋麗影 王曉娜,2 崔 文,2 姜艷平,2 周 晗,2 王 麗,2 喬薪瑗,2 徐義剛，2 李一經(jīng),2 唐麗杰,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)重點實驗室東北科學(xué)觀測實驗站，哈爾濱 150030)

仔豬病毒性腹瀉是哺乳期和斷乳期仔豬的主要腸道疾病，發(fā)病率高、防治困難是造成仔豬生長遲緩和死亡的主要原因[1]，不但給養(yǎng)殖業(yè)帶來直接的經(jīng)濟損失，還為動物食品安全和人類健康埋下隱患[2]。因此，開發(fā)一種安全有效的微生態(tài)制劑，如增強黏膜免疫的益生菌和抗菌肽等，可提高仔豬自身免疫機能、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收及調(diào)節(jié)腸道菌群，對于預(yù)防和控制腹瀉病毒的感染提供新的研究方向。乳酸菌在分子生物學(xué)和基因工程研究中是比較理想的載體[3]。以羅伊氏乳桿菌為材料的微生態(tài)制劑能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[4]、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收[5]、抑制胃腸道內(nèi)病原微生物的增殖[6]，不會產(chǎn)生損害機體的毒素，能刺激身體產(chǎn)生非特異性免疫，尤其是黏膜免疫。研究表明，羅伊氏乳酸桿菌對膽汁和胃酸具有良好的耐受性，且細胞外存在黏附素，因此可以順利到達小腸的上部并對宿主的腸黏膜上皮細胞具有較強的黏附能力[7-8]。Yi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼養(yǎng)中添加羅伊氏乳酸桿菌，可促進仔豬小腸的生長并顯著增加其絨毛高度，從而促進小腸對營養(yǎng)的吸收能力。此外，羅伊氏乳酸桿菌可以促進仔豬腸道緊密連接蛋白的表達并調(diào)節(jié)緊密連接蛋白磷酸化，與黏液補充劑共同作用還可以保護腸道屏障不被抗生素破壞[10]。另外，作為向宿主胃腸道呈遞蛋白質(zhì)的載體，本動物源乳酸菌能夠在腸道中定植，因此可以防止抗菌肽沒有達到靶位點就被降解。也避免為了達到治療效果而提高抗菌肽濃度，從而引起嚴重的毒性和副作用。牛乳鐵蛋白肽(LFCA)是經(jīng)水解作用后由其N端釋放的一種純天然的活性肽，能夠刺激腸道黏膜上皮細胞及淋巴細胞的相互作用增強黏膜免疫，同時促進免疫球蛋白和抗炎因子的產(chǎn)生，具有抗菌、抗病毒和增強機體免疫力等多種生物學(xué)功能[11-13]。Volzing等[14]將異源抗菌肽表達盒基因插入乳酸菌表達載體中，證明其抑菌活性可以不影響宿主，并能打破抗菌肽半衰期以及成本高的限制。本實驗室曾構(gòu)建無需誘導(dǎo)且持續(xù)表達的干酪乳桿菌組成型表達豬抗菌肽[15]，既可以促進小鼠生長，又能改善其機體的免疫功能；構(gòu)建的表達LFCA的重組雞源乳酸桿菌pPG-XLFEC/M11[16]，可以增強機體的免疫應(yīng)答水平，對雛雞抵抗傳染性法氏囊病病毒(IBDV)具有一定的作用。由于LFCA對鐵離子需求低的乳酸菌基本不抑制，同時羅伊氏乳酸桿菌本身對胃腸道環(huán)境有較好的耐受性，能產(chǎn)生有機酸和羅伊氏菌素抑制病原菌的生長，保護腸道的微生態(tài)平衡。因此將羅伊氏乳酸桿菌作為表達LFCA的載體，結(jié)合了宿主菌的天然益生作用和口服制劑的載體優(yōu)勢[17]。本研究將構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達LFCA的重組豬源羅伊氏乳酸桿菌菌株pPG-LFCA/LR-CO21，將能夠引起新生仔豬病毒性腹瀉的重要病原豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)作為感染模型，初步評價該重組菌對仔豬生長性能的影響以及口服保護效果，為該重組菌作為微生態(tài)制劑的應(yīng)用奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒、細胞和菌株

ST細胞、豬源羅伊氏乳桿菌菌株CO-21及TGEV TH98毒株由本實驗室保存；轉(zhuǎn)染過空載體質(zhì)粒的豬源羅伊氏乳酸桿菌菌株pPG/LR-CO21、表達LFCA基因的菌株pPG-LFCA/TG1由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DMEM購自上海源培生物科技股份有限公司；特級新生牛血清購自呼和浩特市草原綠野生物材料有限公司；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司；糞便基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司；熒光探針CFDA-SE購于Sigma公司。CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體購自Sigma生物公司；豬IgG酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒、豬白細胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒、豬腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒和豬分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自武漢酶免生物科技有限公司。LFCA單克隆抗體4E10、TGEV N蛋白單克隆抗體由本實驗室保存。新生仔豬的基礎(chǔ)飼糧為北京中國農(nóng)科院試驗基地生產(chǎn)的代乳粉。

1.1.3 試驗動物

1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬共98只，購于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實驗實習(xí)基地。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試驗1

試驗1研究重組豬源羅伊氏乳桿菌pPG-LFCA/LR-CO21在仔豬體內(nèi)定植情況以及對生長性能的影響。選取1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬36頭，隨機分為3組，每組12頭，群體飼養(yǎng)，仔豬飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實驗實習(xí)基地，采用母豬哺乳喂養(yǎng)的方式。重組菌組口服二乙酰羧基熒光素-琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)標記的pPG-LFCA/LR-CO21(5×109CFU/mL)4 mL，空載菌組口服含有空載體質(zhì)粒的重組豬源羅伊氏乳桿菌pPG/LR-CO21(5×109CFU/mL) 4 mL，對照組口服4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，連續(xù)口服3 d，口服后觀測時間為14 d，每天觀察并記錄各組仔豬體重變化和腹瀉情況，流式細胞術(shù)檢測重組菌在仔豬體內(nèi)不同腸段的定植率。

1.2.2 試驗2

試驗2研究新生仔豬感染TGEV后半數(shù)致死量的條件。選取1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬30頭，仔豬飼養(yǎng)于本實驗室隔離屏障系統(tǒng)，采用人工飼養(yǎng)的方式喂養(yǎng)仔豬配方奶粉，奶粉參照GB 10765—2010營養(yǎng)需要配制，保持仔豬生活環(huán)境溫度為35 ℃，不同試驗組之間仔豬隔離喂養(yǎng)。仔豬每隔4 h飼喂1次，每頭按照7 g奶粉添加42 mL溫水的比例沖泡，奶粉的飼喂溫度為40 ℃。預(yù)先用ST細胞測定TGEV的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為10-7.50/mL，設(shè)計5組感染劑量，分別為口服1、3、6、9、12 mL TCID50為10-7.50/mL的TGEV，設(shè)置7 d時間為觀察期。

1.2.3 試驗3

試驗3研究重組菌對仔豬抵抗TGEV感染的效果分析以及仔豬腸道微生態(tài)平衡的影響。選取1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬32頭，隨機分為4組，每組8頭仔豬。仔豬飼養(yǎng)于本實驗室隔離屏障系統(tǒng)，采用人工飼養(yǎng)的方式喂養(yǎng)仔豬配方奶粉，7日齡前每頭仔豬每隔4 h飼喂1次，7日齡后每頭仔豬每隔6 h飼喂1次(10 g奶粉加60 mL溫開水比例沖泡)。重組菌組每頭每天口服pPG-LFCA/LR-CO21(5×109CFU/mL)4 mL，空載菌組每頭每天口服pPG/LR-CO21(5×109CFU/mL)4 mL，對照組及TGEV感染組每頭每天飼喂4 mL的PBS，連續(xù)口服飼喂7 d，在8日齡感染組口服6 mL TCID50為 10-7.50/mL的病毒液，感染7 d后進行樣品采集。

1.3 測定方法

1.3.1 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21的構(gòu)建與蛋白表達

將實驗室保存的LR-CO21于MRS培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至吸光度(OD)600 nm為0.4～0.8。冰浴后4 ℃離心，沉淀用預(yù)冷的溶液重復(fù)洗滌，制備LR-CO21感受態(tài)細胞。對pPG-LFCA/TG1菌株提取質(zhì)粒pPG-LFCA，電轉(zhuǎn)化至羅伊氏乳酸桿菌LR-CO21感受態(tài)細胞中，涂布于5 μg/mL氯霉素抗性的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。隨機挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，將鑒定正確的重組豬源羅伊氏乳酸桿菌兼性厭氧培養(yǎng)16～18 h后取樣，通過超聲處理菌液沉淀，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，以實驗室制備的LFCA單克隆抗體4E10作為一抗，以HRP標記的山羊抗鼠IgG作為二抗進行Western blot鑒定。用人工合成的標準蛋白以不同濃度包被孔板，設(shè)置3個平行孔，進行3次重復(fù)試驗。按照1∶400比例稀釋制備的LFCA單克隆抗體4E10，繪制LFCA定量曲線。將培養(yǎng)時間為8、10、12、14、16、18、20、22、24 h的pPG-LFCA/LR-CO21上清和菌體進行酶聯(lián)免疫吸附試驗，根據(jù)標準曲線計算重組菌表達LFCA的含量，最終得到重組菌表達LFCA的最佳條件。

1.3.2 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21對新生仔豬生長性能的影響

將36頭1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬隨機分成3組，每組12頭，群體飼養(yǎng)，3個組分別為重組菌組、空載菌組、對照組，試驗期間3個組于1～3日齡每天每頭按照2×1010CFU的劑量口服，重組菌組口服CFDA-SE標記的pPG-LFCA/LR-CO21(5×109CFU/ml)4 mL，空載菌組口服含有空載體質(zhì)粒的pPG/LR-CO21(5×109CFU/mL)4 mL，均通過PBS進行稀釋,對照組口服等體積的PBS，連續(xù)口服3 d，口服后觀測時間為14 d。試驗期間仔豬奶粉主要組成為：全脂奶粉、濃縮乳清蛋白、乳清粉、乳糖、乳脂肪、維生素、有機微量元素、活性酵母、果寡糖、甘露寡糖等，奶粉營養(yǎng)成分見表1。試驗第1～17天，每天對個體進行稱重并記錄，計算平均日增重(ADG)，腹瀉評分標準如表2所示。相關(guān)計算公式如下：

表1 奶粉營養(yǎng)成分Table 1 Nutrition of milk powder %

表2 仔豬腹瀉評分標準Table 2 Score criterion for diarrhea of piglets

ADG(kg/d)=總增重/試驗天數(shù)；腹瀉率(%)=[總腹瀉頭數(shù)/(仔豬頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100。

1.3.3 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21在新生仔豬體內(nèi)的定植效果分析

CFDA-SE是一種可對活細胞進行非特異性熒光標記的細胞染色試劑。將10 mmol/L CFDA-SE儲存液用PBS按1∶800稀釋成工作液，調(diào)整菌液濃度約為5×108CFU/mL后與等量CFDA-SE工作液混合均勻，37 ℃水浴30 min，離心并用PBS清洗2次，0.75%的甲醛溶液固定后，通過流式細胞術(shù)檢測重組豬源羅伊氏乳酸桿菌的陽性標記率。在連續(xù)口服重組菌后4、7、14 d，對重組菌組仔豬刮取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸腸段黏液樣本，流式細胞術(shù)分析重組菌在仔豬各腸段的定植率。

1.3.4 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21對新生仔豬感染TGEV的效果分析

用ST細胞預(yù)先測定TGEV TCID50為10-7.50/mL，選取1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬30頭，按照感染劑量分為5組，分別口服1、3、6、9、12 mL TCID50為10-7.50/mL的TGEV。設(shè)置7 d時間為觀察期，分析半數(shù)致死量的條件。另外重新選取36頭1日齡、體重約為1.5 kg的新生杜長大仔豬，隨機分為4組，分別為重組菌組、空載菌組、對照組及TGEV感染組，每天每頭按照2×1010CFU的劑量分別口服CFDA-SE標記的pPG-LFCA/LR-CO21、含有空載體質(zhì)粒的pPG/LR-CO21、等體積的PBS，口服7 d后按照半數(shù)致死劑量口服6 mL TCID50為10-7.50/mL的TGEV，感染7 d后(有死亡仔豬及時剖檢)，對4組試驗仔豬進行樣品采集。飼喂期間記錄仔豬的ADG、腹瀉率，設(shè)置7 d的觀察期，計算重組菌對仔豬感染TGEV后的存活率的影響。對仔豬進行剖殺，腸道組織用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片及蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察小腸病理學(xué)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測仔豬血清中總IgG和腸黏液總sIgA抗體含量；液氮研磨后，Trizol法提取腸組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR測定仔豬腸黏膜組織中緊密連接蛋白相關(guān)基因封閉蛋白-1(Claudin-1)、閉合蛋白(Occludin)和緊密連接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α及Toll樣受體2(TLR2)mRNA相對表達量。

為檢測重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的腸道微生物生態(tài)平衡的影響，利用天根糞便基因組提取試劑盒提取糞便中的DNA。設(shè)計16S rDNA引物進行細菌標準V3～V4區(qū)擴增。反應(yīng)程序如下：第1輪擴增，預(yù)變性94 ℃，2 min；變性98 ℃，10 s；退火62℃，30 s；延伸68 ℃，30 s；設(shè)置30個循環(huán)；終延伸68 ℃，5 min。經(jīng)PCR產(chǎn)物純化定量后進行第2輪擴增：預(yù)變性94 ℃，2 min；變性98 ℃，10 s；退火65 ℃，30 s；延伸68 ℃，30 s；設(shè)置12個循環(huán)；終延伸68 ℃，5 min。經(jīng)第2輪擴增產(chǎn)物純化定量完成后上機測序。根據(jù)操作分類單元(OTU)種類數(shù)量分析菌群多樣性、物種菌群組成及腸道菌群功能，本研究后續(xù)的測序和生物信息服務(wù)在廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3.5 生物學(xué)分析

α多樣性常使用物種豐富度與均勻度來計算，一般用來評估特定生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性情況。Good’s Coverage主要關(guān)心樣本的低豐度OTU覆蓋情況；observed_species反映樣本的OTU種類；Chao1、ACE指數(shù)表示能檢測到的物種豐富度；Simpson、Shannon指數(shù)可以綜合表現(xiàn)物種的豐富度和均勻度。優(yōu)勢物種很大程度上決定著微生物群落的生態(tài)結(jié)構(gòu)以及功能結(jié)構(gòu)，本試驗用堆疊圖的形式，直觀展示腸道菌群在屬的水平上的相對豐度。PICRUSt軟件首先根據(jù)已知物種基因組搭建一個“物種-基因”的關(guān)系網(wǎng)，然后利用OTU序列信息找到“最近物種”，并根據(jù)已知物種的基因種類和豐度信息，來對未知物種的遺傳信息進行預(yù)測，從而結(jié)合基因的KEGG通路信息來預(yù)測整個群落的通路情況，最后達到功能分析的目的。使用PICRUSt軟件進行KEGG Pathway的功能注釋，統(tǒng)計Pathway和KO的豐度信息，并繪制KEGG 數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計圖。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)主要采用GraphPad Prism7統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示，并進行組間多重比較，其中*代表差異顯著(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21的鑒定

提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定目的片段大小為341 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。對重組菌pPG-LFCA/LR-CO21和空載菌pPG/LR-CO21進行Western blot鑒定，結(jié)果顯示(圖2)，化學(xué)發(fā)光顯色液(ECL)顯色后重組菌pPG-LFCA/LR-CO21在約4.6 ku處出現(xiàn)特異性的反應(yīng)帶，而空載菌未見條帶。LFCA含量與OD450 nm值的關(guān)系為y=0.932 4x+0.005 4(圖3)。根據(jù)標準曲線計算重組菌表達LFCA的含量，可見培養(yǎng)18 h后LFCA的表達量最大，菌體的最大表達量為1.33 μg/mL，上清的最大表達量為1.03 μg/mL(表3)。這表明LFCA在重組菌中獲得表達，重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21構(gòu)建成功。

表3 重組牛乳鐵蛋白肽表達條件的優(yōu)化Table 3 Optimization of recombinant bovine lactoferrin peptide expression conditions μg/mL

M：DNA分子量標準DL2000；1：重組質(zhì)粒pPG-LFCA；2：空載質(zhì)粒pPG。M: DNA Marker DL2000; 1: recombinant plasmid pPG-LFCA; 2：empty vector plasmid pPG.圖1 重組質(zhì)粒pPG-LFCA PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of recombinant plasmid pPG-LFCA

M：小分子量蛋白標準Marker；1：重組菌pPG-LFCA /LR-CO21上清；2：重組菌pPG-LFCA /LR-CO21菌體；3：空載菌pPG /LR-CO21上清；4：空載菌pPG /LR-CO21菌體。M: low molecular weight protein Marker；1：the supernatant of recombinant bacteria pPG-LFCA LR-CO21；2：the bacteriophage of recombinant bacteria pPG-LFCA /LR-CO21；3：the supernatant of empty vector bacteria pPG/LR-CO21；4: the bacteriophage of empty vector bacteria pPG /LR-CO21.圖2 重組豬源羅伊氏乳桿菌表達產(chǎn)物的Western blot鑒定結(jié)果Fig.2 Western blot identification results of recombinant porcine Lactobacillus reuteri expression products

圖3 牛乳鐵蛋白肽的定量標準曲線Fig.3 Standard curve for quantity of bovine lactoferrin peptides

2.2 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對新生仔豬生長性能的影響

由圖4可知，重組菌組和對照組相比提高了新生仔豬的ADG，差異極顯著(P<0.01)，在觀測的第14天測定空載菌組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。由此結(jié)果可見，在口服表達LFCA的pPG-LFCA/LR-CO21能夠提高新生仔豬的生長性能，對新生仔豬的生長有一定的促進作用。

“*”表示與對照組相比差異顯著(P<0.05), “**”表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖5、圖11同。Compared with the control group, “*”mean significant difference (P<0.05), and “**” mean extremely significant difference (P<0.01). The same as Fig.5 and Fig.11.圖4 重組豬源羅伊氏乳桿菌對仔豬ADG的影響Fig.4 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on ADG of piglets

由圖5可知，重組菌組與對照組相比較，腹瀉率降低且差異極顯著(P<0.01)，表明口服表達LFCA的重組豬羅伊氏乳桿菌，能夠降低新生仔豬的腹瀉率，提高新生仔豬機體的免疫力。

圖5 重組豬源羅伊氏乳桿菌對仔豬腹瀉率的影響Fig.5 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on diarrhea rate of piglets

2.3 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌在新生仔豬體內(nèi)定植能力分析

流式細胞術(shù)檢測顯示，重組菌的標記陽性率為99.4%(圖6)，在口服后的4、7、14 d，重組豬源羅伊氏乳桿菌在仔豬各腸段均可定植，其中在空腸、回腸定植效果較好，結(jié)果見圖7、表4。

表4 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌在仔豬腸道定植率的測定Table 4 Determination of intestinal colonization ability of recombinant porcine Lactobacillus reuteri in piglets %

圖6 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌以CFDA-SE標記的陽性率Fig.6 Recombinant porcine Lactobacillus reuteri positive rate of CFDA-SE labeling

A：十二指腸 duodenum；B：空腸 jejunum；C：回腸 ileum；D：盲腸 cecum；E：結(jié)腸 colon。Conunt:數(shù)量；FITC-A:FITC通道 FITC passway。圖7 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌在仔豬腸道定植的檢測Fig.7 Detection of intestinal colonization ability of recombinant porcine Lactobacillus reuteri in piglets

2.4 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對仔豬抵抗TGEV感染的效果分析

2.4.1 TGEV對于仔豬半數(shù)致死量的測定

如圖8所示，結(jié)果表明達到半數(shù)致死量的條件為口服感染6 mL TCI50為10-7.50/mL的病毒液。后續(xù)試驗用此感染劑量進行病毒感染試驗。

圖8 半數(shù)致死量感染條件Fig.8 Median lethal dose infect conditions

2.4.2 口服重組菌對感染TGEV的仔豬ADG、腹瀉率的影響

TGEV感染后1～7 d，重組菌組和空載菌組較TGEV感染組ADG增加，出現(xiàn)體重負增長的時間點延后(圖9-A)；腹瀉率降低，出現(xiàn)腹瀉率最高峰的時間點延后(圖9-B)。由此可見，口服表達LFCA的重組菌組較TGEV感染組可以減緩TGEV對仔豬生長性能造成的不良影響。

A：重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬ADG的影響；B：重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬腹瀉率的影響。A: effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on ADG of piglets infected with TGEV；B: effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on diarrhea rate in piglets infected with TGEV.圖9 口服重組菌對感染TGEV的仔豬ADG、腹瀉率的影響Fig.9 Effects of oral recombinant bacteria on ADG and diarrhea rate in piglets infected with TGEV

2.4.4 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV的仔豬小腸組織形態(tài)的影響

由表5可知，重組菌組與感染TGEV組仔豬相比，顯著增加了仔豬空腸和回腸絨毛高度(P<0.05)，顯著增加了十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度/隱窩深度的比值(P<0.05)。TGEV感染組仔豬十二指腸黏膜絨毛高度變短，固有層可見少量嗜酸性粒細胞及嗜中性粒細胞，重組菌組炎性細胞減少；TGEV感染組空腸黏膜固有層可見大量炎性細胞浸潤，膜絨毛斷裂，上皮大量脫落，重組菌組相比TGEV感染組仔豬癥狀明顯減輕；TGEV感染組回腸黏膜絨毛高度變短，固有層可見少量嗜酸性粒細胞浸潤，隱窩數(shù)量較多損壞，此病變在重組菌組有所恢復(fù)。結(jié)果見圖10。

圖10 仔豬小腸組織病理變化Fig.10 Pathology change of piglet small intestine (100×)

表5 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對仔豬小腸組織形態(tài)的影響Table 5 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on tissue morphology of small intestine in piglets

續(xù)表5項目 Items對照組Control group空載菌組pPG/LR-CO21 group重組菌組pPG-LFCA/LR-CO21 groups感染TGEV組TGEV infect group回腸 Ileum絨毛高度Villous height/μm170.02±35.71a143.75±23.90b158.37±25.31b90.44±23.58c隱窩深度Crypt depth/μm89.10±29.5081.25±25.0691.07±11.1684.82±24.11絨毛高度/隱窩深度V/C1.90±0.41a1.76±0.30a1.73±0.17a1.06±0.28b

2.4.3 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV的仔豬免疫球蛋白及炎性細胞因子、緊密連接蛋白的影響

由圖11可知，在仔豬口服重組菌7 d后進行感染，從結(jié)果中可以看出，重組菌可以有效提高血清免疫球蛋白的含量，其中血清總IgG抗體含量較對照組差異顯著(P<0.05)，腸黏液中總sIgA抗體含量較對照組差異顯著(P<0.05)。

圖11 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV的仔豬血清免疫球蛋白含量Fig.11 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on serum immunoglobulin contents of piglets infected with TGEV

由圖12可知，細胞緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 mRNA相對表達量與TGEV感染組比較均有增加，且差異極顯著(P<0.01)。具有廣譜抗病毒活性的細胞因子IFN-γ以及相關(guān)細胞因子IL-6、IL-8、TLR-2、TNF-α的mRNA相對表達量與TGEV感染組比較均有增加，且差異極顯著(P<0.01)。

圖12 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV的仔豬腸黏膜組織炎性細胞因子、緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響Fig.12 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines and tight junction proteins in intestinal mucosa of piglets infected with TGEV

2.4.5 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的保護效果

在感染后的7 d，TGEV感染組的8只仔豬死亡率達62.5%，重組菌組的死亡率為37.5%，空載菌組為50%，表明pPG-LFCA/LR-CO21對感染TGEV的新生仔豬具有一定的保護作用，結(jié)果見圖13。

圖13 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的保護效果Fig.13 Protective effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on piglets infected with TGEV

2.4.6 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的腸道微生物生態(tài)平衡的影響

使用物種豐富度與均勻度計算α多樣性，結(jié)果見圖14-A。TGEV感染后的3個組仔豬腸道菌群物種菌群總量及多樣性較對照組均有上升，重組菌組菌群總量與TGEV感染組相差較小，而菌群多樣性較TGEV感染組相比有所下降，更接近對照組，表明TGEV感染后對口服重組菌的仔豬腸道菌群平衡的破壞程度較TGEV感染組更小。

采用堆疊圖的形式，從屬水平上分析不同樣品物種豐度的情況，結(jié)果見圖14-B。仔豬腸道菌群在屬水平上占比較高的為真桿菌屬、擬普雷沃菌屬、大腸埃希氏菌屬、梭菌屬。相較于對照組，在TGEV感染后，大腸埃希氏菌屬、梭菌屬占比下降，擬桿菌屬占比上升，而重組菌組較TGEV感染組條件致病菌擬桿菌屬占比下降。

A：以各組為單位的α多樣性指數(shù)圖；B：腸道菌群在屬水平上的相對豐度。A: Alpha diversity index figure of each group；B: the intestinal flora of relative abundance at the genus level.Unclassified：未分類菌屬；Other：其他菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Prevotella_2：普雷沃菌屬_2；Bacteroides：擬桿菌屬；Ruminococcaceae_UCG-002：疣微菌科UCG-002；Fusobacterium：梭菌屬；Escherichia-Shigella：大腸埃希氏菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Eubacterium_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真桿菌屬群。圖14 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的腸道微生物α多樣性及在屬的水平上的相對豐度Fig.14 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on alpha diversity and relative abundance at the genus level of intestinal microorganisms in piglets infected with TGEV

繪制KEGG數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計圖(圖15)。結(jié)果表明，在糖的生物合成代謝、生物降解代謝、信號分子相互作用功能上，對照組較其他3組更強。而在其他絕大多數(shù)功能上，如膜運輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等能力上，重組菌組相較于其他3組更強。

圖15 重組豬源羅伊氏乳酸桿菌對感染TGEV仔豬的腸道菌群功能預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計圖Fig.15 Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri on statistical diagram of intestinal flora function prediction results in piglets infected with TGEV

3 討 論

羅伊氏乳酸桿菌在動物腸道內(nèi)分布廣泛，在調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)和黏膜免疫方面具有重要作用，近年來已逐步成為研究的熱點[18]。已有研究表明，理想的益生菌種最好是在本動物腸道的定植菌株中分離出來的[19]，因此本試驗豬源羅伊氏乳酸桿菌LR-CO21從仔豬體內(nèi)分離篩選，具有較強耐酸、耐膽鹽以及良好定植能力[20]，可以在體內(nèi)長期存留。乳酸菌質(zhì)粒表達系統(tǒng)操作簡單，表達量高，相對于大腸桿菌具有更好的安全性和益生特性，因此應(yīng)用乳酸桿菌作為表達不同生物學(xué)功能外源蛋白的載體[21-22]。目前，乳鐵蛋白肽研究較多的2段序列為LFCA Lfcin、LFampin 2個片段[23]，與其他哺乳動物所產(chǎn)生的乳鐵蛋白肽相比活性更高[24]，其所具有的螺旋結(jié)構(gòu)、疏水性、兩親性和強陽離子特性是它們抗病原微生物的關(guān)鍵[25]。本研究利用本實驗室構(gòu)建的含有組成型強啟動子HCE、增強子T7g10、肽聚糖水解酶信號肽以及用linker連接的依據(jù)乳酸桿菌密碼子偏嗜性優(yōu)化的2段LFCA (LFcinB和LFampin)與大腸桿菌強終止子rrnB T1T2串聯(lián)的表達盒重組質(zhì)粒pPG-LFCA，將其電轉(zhuǎn)化到豬源乳酸桿菌LR-CO21中，構(gòu)建表達LFCA的重組豬源羅伊氏乳桿菌pPG-LFCA/LR-CO21，研究其抗菌、抗病毒活性及其對仔豬生長的影響。由于本試驗使用的表達載體是組成型表達載體，因此目的蛋白的表達無需額外添加誘導(dǎo)劑[26]，能夠解決規(guī)模化生產(chǎn)的難題。

試驗期間仔豬于飼養(yǎng)室隔離飼養(yǎng)，重組菌構(gòu)建以及飼喂過程均嚴格按照實驗室規(guī)范進行操作，仔豬產(chǎn)生的糞尿及剖殺后仔豬均用3%消毒液噴灑后裝入塑料袋，送到指定焚燒地點焚燒處理。通過流式細胞術(shù)對重組豬源羅伊氏乳酸桿菌在新生仔豬體內(nèi)定植能力分析，結(jié)果表明，在口服后第3天定植效果足夠好，14 d后檢測重組菌仍能在各腸段定植，另外，用TGEV病毒對早期重組菌定植后仔豬感染時試驗效果會更加明顯。將飼喂重組豬源羅伊氏乳酸桿菌的仔豬感染TGEV TH98毒株，由于腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)的完整性是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和機體健康生長的保證，并且小腸在防御病原體入侵方面也起著關(guān)鍵作用[27]，因此通過檢測腸道形態(tài)、絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度的比值等指標來評價腸道的生長發(fā)育狀況[28]，絨毛高度/隱窩深度的比值越高，表明腸道發(fā)育情況越好。重組菌組與TGEV感染組相比，顯著增加了仔豬十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度/隱窩深度的比值，且重組菌組回腸的絨毛高度/隱窩深度的比值接近正常組，表明口服重組菌可減輕TGEV感染仔豬的空腸和回腸的腸絨毛斷裂，能夠增強小腸的吸收能力，并可對腸道環(huán)境起到一定的保護作用。腸道屏障是機體抵御病原微生物入侵的第1道防線[29]，多種蛋白相互作用而形成緊密連接蛋白的復(fù)合結(jié)構(gòu)[30]，其組成成分包括支架蛋白(如ZO-1)和跨膜蛋白(如Occludin、Claudin-1)具有選擇通透作用，可以阻止消化道內(nèi)細菌、毒素等物質(zhì)的胞旁轉(zhuǎn)運[31]。Yi等[32]的研究結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌可以增加Occludin及ZO-1的表達量，對腸道上皮屏障功能具有益生作用，可以修復(fù)腸道疾病導(dǎo)致的上皮屏障功能受損。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌組較TGEV感染組極顯著上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin及ZO-1在小腸組織中mRNA的相對表達量，表明重組豬源羅伊氏乳酸桿菌可以促進腸道組織中緊密連接蛋白的表達，增強仔豬腸道屏障作用。細胞因子是指主要由免疫活性細胞合成和分泌的一類具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)多肽分子，具有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。IFN-γ因其廣譜的抗病毒及抗腫瘤的作用，目前已成為免疫檢測中重要指標[33]。細胞因子白細胞介素由活化的單核巨噬細胞及淋巴細胞等產(chǎn)生，主要調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞的增殖與分化，并在抗病毒免疫中負責(zé)信號傳遞，進而機體免疫系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)肝細胞合成TNF-α、IL-6和IL-8[34]等細胞因子，參與炎癥反應(yīng)。LFCA可以一定程度上抑制炎性細胞因子，但本試驗測定的是炎癥早期反應(yīng)引起的細胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化。Xia等[35]的研究表明，TGEV感染仔豬后，多種腸道炎性因子mRNA相對表達量升高，在病毒刺激機體產(chǎn)生免疫的早期，炎性細胞因子水平升高可以起到相應(yīng)的抗病毒效果。在本試驗中重組菌組對比于TGEV感染組腸道組織中TLR2 mRNA相對表達量上調(diào)，且差異極顯著；進一步激活I(lǐng)FN-γ，使其表達量上調(diào)，且與TGEV感染組相比差異極顯著。TLR2的mRNA相對表達量上調(diào)，同樣激活I(lǐng)L-6、IL-8、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；這些細胞因子有助于誘導(dǎo)T、B細胞的分化增殖，參與炎癥反應(yīng)，機體通過炎癥反應(yīng)能夠減緩或阻止病原體經(jīng)組織間隙向機體的其他部位擴散，為吞噬細胞發(fā)揮功能提供條件，從而達到抗病毒的效果。本研究通過直接口服重組菌，用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測受到病毒感染后仔豬血清中總IgG和腸黏液總sIgA抗體含量。結(jié)果表明，重組菌組2種抗體含量上調(diào)，且較TGEV感染組差異顯著，說明重組菌可以增強機體體液和黏膜免疫的免疫能力。動物腸道菌群失衡會導(dǎo)致腸道屏障功能破壞，消化功能紊亂和免疫功能異常[36]。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，腸道微生物已被視為一種多基因性狀[37]，不僅能使機體產(chǎn)生對病原體的屏障，在宿主的代謝、免疫和生理等方面也具有多重功能。對TGEV感染后的仔豬腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進行分析，可見TGEV感染后引起的腸道菌群失衡可能是導(dǎo)致重組菌組、空載菌組和TGEV感染組腸道菌群物種菌群總量及多樣性比對照組高的原因。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的物種注釋和OTU豐度信息，使用PICRUSt軟件進行KEGG Pathway的功能注釋，表明新生仔豬在口服重組菌后能促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收及提高免疫力，從而抵御TGEV的感染。梁秀麗等[38]的研究同樣表明，抗菌肽B-13可以調(diào)節(jié)感染TGEV仔豬盲腸微生物菌群的多樣性和豐富度，并在TGEV感染的情況下起到降低腹瀉率、調(diào)控盲腸微生物健康區(qū)系和改善腸道形態(tài)發(fā)育的作用。重組菌對TGEV感染仔豬存活率的影響結(jié)果表明，空載菌本身也對TGEV有一定的抑制作用，但其作用效果沒有重組菌明顯，主要原因在于羅伊氏乳酸桿菌本身能夠提升機體非特異性免疫。

4 結(jié) 論

本試驗構(gòu)建了表達LFCA的重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21，該重組菌能夠促進新生仔豬生長，增強抵抗力，在仔豬腸道內(nèi)具有良好的定植能力并可以降低TGEV對仔豬腸道的損傷，對仔豬抗TGEV感染提供有效保護。TGEV感染仔豬后，仔豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量都發(fā)生顯著變化，仔豬腸道正常菌群占比下降；口服重組菌的仔豬腸道菌群較TGEV感染組條件致病菌擬桿菌屬占比下降，菌群多樣性更接近對照組，腸道菌群的代謝、遺傳信息處理等功能均有所增強。