阿麗亞?依拉木 阿布都艾則孜?艾爾肯 閆波 艾爾菲丁?阿尼娃爾 木巴拉克?伊明江

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）03-0326-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.03.12

摘 要 目的 基于蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）信號(hào)通路研究沒食子乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、Caco-2增殖、遷移的調(diào)控機(jī)制。方法 采用CCK-8法檢測(cè)0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL沒食子乙醇提取物作用12、24、48、72 h后對(duì)HCT-116、Caco-2細(xì)胞增殖的影響。以0.1、0.3、0.5 mg/mL 沒食子乙醇提取物作用于HCT-116、Caco-2細(xì)胞24 h后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷移情況，采用熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中JAK2、STAT3磷酸化水平和B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)水平。結(jié)果 與空白對(duì)照比較，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 沒食子乙醇提取物作用12、24、48、72 h后均可顯著抑制細(xì)胞增殖（P<0.05）。0.1、0.3、0.5 mg/mL 沒食子乙醇提物作用24 h后，2種細(xì)胞的劃痕愈合率和細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平，以及細(xì)胞中JAK2、STAT3磷酸化水平和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;細(xì)胞內(nèi)ROS水平、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 沒食子乙醇提取物可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、Caco-2的增殖和遷移，其機(jī)制可能與增加細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，下調(diào)腫瘤微環(huán)境中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)和JAK2/STAT3信號(hào)通路中JAK2、STAT3的磷酸化水平，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 沒食子乙醇提取物;結(jié)腸癌細(xì)胞;炎癥因子;活性氧;蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3信號(hào)通路

Study on regulation of ethanol extract of Turkish Galls on JAK2/STAT3 signaling pathway in colorectal cancer cells

Aliya·Elham1，Abdulaziz·Arken1，YAN Bo2，Arfidin·Anwar1，Mubarak·Iminjan1（1. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China; 2. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the regulatory mechanism of ethanol extract of Turkish Galls on proliferation and migration of colorectal cancer cells HCT-116 and Caco-2 based on janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway. METHODS CCK-8 method was used to detect the effects of 0.05， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4 and 0.5 mg/mL ethanol extract of Turkish Galls on the proliferation of HCT-116 and Caco-2 cells after treated for 12， 24， 48 and 72 h. After treated with 0.1， 0.3， 0.5 mg/mL ethanol extract of Turkish Galls for 24 h， the migrations of HCT-116 and Caco-2 cells were detected by scratch test; the level of reactive oxygen species （ROS） was detected by fluorescent probe method. The levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in cell supernatant were detected by ELISA. The phosphorylations of JAK2 and STAT3 as well as the expressions of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and Bcl-2 associated protein X （Bax） were detected by Western blot assay. RESULTS Compared with blank control， 0.05， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4 and 0.5 mg/mL ethanol extract of Turkish Galls could significantly inhibit cell proliferation after treated for 12， 24， 48， 72 h （P<0.05）. After treated with 0.1， 0.3 and 0.5 mg/mL ethanol extract of Turkish Galls for 24 h， the scratch healing rate of 2 kinds of cells， the levels of IL-6 and TNF-α in the cell supernatant， the phosphorylation of JAK2 and STAT3 as well as the expression of Bcl-2 protein were all significantly decreased （P<0.05）; the level of ROS and protein expression of Bax were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS The ethanol extract of Turkish Galls can inhibit the proliferation and migration of HCT-116 and Caco-2 cells. The mechanism may be related with down-regulation of protein expression of Bcl-2 and up-regulation of protein expression of Bax by increasing the accumulation of intracellular ROS， down-regulating the expressions of inflammatory factors IL-6 and TNF-α and the phosphorylation of JAK2 and STAT3 in JAK2/STAT3 signaling pathway.

KEYWORDS? ?ethanol extract of Turkish Galls; colorectal cancer cell; inflammatory factor; reactive oxygen species; janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的、具有較高發(fā)病率和病死率的惡性腫瘤之一，其發(fā)病是多基因、多因素參與的復(fù)雜過程[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在2020年，結(jié)腸癌的發(fā)病率已高居世界第4位，每年約有115萬人被診斷為結(jié)腸癌[2]。手術(shù)切除、輔助化療是臨床治療結(jié)腸癌的主要手段，但在治療過程中其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，總體預(yù)后不理想[3]。中藥治療結(jié)腸癌在改善患者術(shù)后狀態(tài)、降低毒副反應(yīng)、提高化療效率等方面具有一定優(yōu)勢(shì)，因此，安全又經(jīng)濟(jì)的天然藥物成為了抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[4-6]。

沒食子為癭蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.的幼蟲寄生于殼斗科櫟屬植物沒食子樹Quercus infectoria Oliv.幼枝上產(chǎn)生的蟲癭，在民間具有悠久的臨床應(yīng)用歷史，常用于治療盜汗咳嗽、咯血便血、口瘡齒痛等[7]。沒食子中多酚類化學(xué)成分的含量為50%～70%、沒食子酸的含量為2%～4%，另外還有類黃酮、三烯類、揮發(fā)油類、皂苷類、生物堿類、蒽醌類、多糖類、鞣花酸及樹脂等成分[7]。據(jù)報(bào)道，沒食子能夠通過減少細(xì)胞炎癥因子的分泌而減輕炎癥損傷，并通過清除自由基增強(qiáng)組織的抗氧化活性，改善促炎因子與抗炎因子之間的失衡，修復(fù)損傷部位[8]。研究證實(shí)，沒食子能夠通過抑制Janus激酶（janus kinase，JAK）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）途徑治療炎癥性腸病[9]。JAK/STAT信號(hào)通路參與了腫瘤細(xì)胞中多種生物變異過程的調(diào)控，該通路的過度激活與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[10]。

在前期研究中，本課題組采用丙酮、乙醇、甲醇和水4種溶劑對(duì)沒食子藥材進(jìn)行提取，得到了成分組成相同但含量不同的4種提取物，并通過體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沒食子乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、Caco-2的增殖抑制作用最強(qiáng)。因此，本研究以沒食子乙醇提取物（后文簡(jiǎn)稱為“沒食子醇提物”）為研究對(duì)象，檢測(cè)其對(duì)HCT-116、Caco-2細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累，JAK2/STAT3信號(hào)通路上游炎癥因子白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和通路相關(guān)蛋白JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）的表達(dá)，以及通路下游B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）表達(dá)的影響，為沒食子治療結(jié)腸癌的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Forma371型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），H17502型高速離心機(jī)（湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司），HHS-11-1型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），MAX-A6003型電子天平（深圳無限量衡器有限公司），SX-500型高壓滅菌鍋（北京天美科學(xué)儀器有限公司），TS2型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），PP-1150 Power B型蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京凱元信瑞儀器有限公司），F(xiàn)luorChem E Alpha型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有5-氟尿嘧啶（5-fluo- rouracil，5-FU）對(duì)照品（純度99.0%）、RIPA高效裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL超敏發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1209KG022、R0010、PC0020、PE0020）;高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、進(jìn)口澳洲胎牛血清、100×青霉素/鏈霉素雙抗混合液、胰蛋白酶-EDTA、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、谷氨酰胺（以色列BI公司，批號(hào)分別為2043176、04-002-1C、03-031- 5B/C、03-050-1BCS、2038149、03-42-3BC）;CCK-8試劑盒、活性氧熒光探針（DCFH-DA）試劑盒（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為7010000、BL714A）;IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為JL14113、JL10208）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳快速制備試劑盒（北京博泰斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)WB2101）、脫脂奶粉（德國(guó)BioFroxx公司，批號(hào)1172GR100）、預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)26616）;兔源Bcl-2、Bax、JAK2、p-JAK2、STAT-3、p-STAT-3單克隆抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為4223T、2772T、3230T、3771S、4904T、9145T）;兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為BS-0061R、BS-40295G-HRP）。

1.3 藥材

沒食子藥材于2016年購(gòu)自廣州市，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)教授鑒定為真品，標(biāo)本保存于新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室藥劑組，標(biāo)本號(hào)為20160305。

1.4 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和Caco-2均購(gòu)買于武漢普諾賽生物科技有限公司，批號(hào)分別為201201D11、201228D50，收到后常規(guī)傳至第3代備用。

2 方法

2.1 沒食子醇提物的制備

采用文獻(xiàn)[11]報(bào)道的提取方法，取沒食子干燥果實(shí)適量，粉碎成80目細(xì)粉;取50 g細(xì)粉，加入8倍量（以mL/g計(jì)）無水乙醇加熱回流提取3次、每次0.5 h;合并3次提取液，減壓濃縮（50 ℃）并干燥成浸膏（浸膏得率為77.96%），即得沒食子醇提物[其中多酚類成分的總含量為（447.59±2.64） mg/g，沒食子酸的含量為（71.18±0.41） mg/g]，使用時(shí)用PBS溶解并稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的工作液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至皿面積的70%左右時(shí)，用胰酶消化傳代（其中HCT-116細(xì)胞消化1 min，Caco-2細(xì)胞消化5 min）。待細(xì)胞貼壁后，再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HCT-116、Caco-2細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，分別以每孔2 000個(gè)細(xì)胞均勻接種在96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（不加任何藥物處理培養(yǎng)的細(xì)胞）、5-FU組[陽(yáng)性對(duì)照，預(yù)實(shí)驗(yàn)得5-FU干預(yù)2種細(xì)胞24 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）≈0.05 mg/mL，因此本研究中將其質(zhì)量濃度設(shè)為0.05 mg/mL]和不同質(zhì)量濃度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置）的沒食子醇提物組，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)空白調(diào)零孔（不加細(xì)胞、只加培養(yǎng)液）。分別在培養(yǎng)12、24、48、72 h時(shí)，根據(jù)說明書每孔加入適量用培養(yǎng)液稀釋過的CCK-8溶液，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中靜置2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=[1-（給藥組A-空白調(diào)零孔A）/（空白對(duì)照組A-空白調(diào)零孔A）]×100%;并采用SPSS 26.0軟件計(jì)算沒食子醇提物作用不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞遷移情況檢測(cè)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT- 116、Caco-2細(xì)胞，分別以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔板底部，采用無菌槍頭在皿底劃出等寬的直線劃痕，并采用無菌PBS清洗3次。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、5-FU組（0.05 mg/mL）和不同質(zhì)量濃度（0.1、0.3、0.5 mg/mL）的沒食子醇提物組，每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0 h及常規(guī)培養(yǎng)24 h時(shí)，在顯微鏡下觀察并采集圖片，用Image J V1.8.0軟件分析劃痕面積并計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率（%）=（0 h時(shí)劃痕面積-培養(yǎng)24 h時(shí)劃痕面積）/0 h時(shí)劃痕面積×100%]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

采用DCFH-DA法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116、Caco-2細(xì)胞，分別按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)和分組（本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照藥物選用試劑盒自帶試劑Rosup，按照說明書將質(zhì)量濃度設(shè)為0.05 mg/mL），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后加入20 μmol/L DCFH-DA，在37 ℃條件下培養(yǎng)30 min;PBS洗滌細(xì)胞3次后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光情況并采集圖片，用Image J V 1.8.0軟件分析每組細(xì)胞熒光強(qiáng)度百分比（所采集視野內(nèi)熒光強(qiáng)度在整個(gè)視野中所占的百分比），以此表示細(xì)胞內(nèi)的ROS水平（熒光強(qiáng)度百分比越高，表示細(xì)胞中ROS水平越高）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平檢測(cè)

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116、Caco-2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)和分組，每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書方法操作，測(cè)定其中IL-6、TNF-α水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116、Caco-2細(xì)胞，分別按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，然后使用含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞中的總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白的濃度后，將蛋白進(jìn)行高溫變性。將30 μg變性蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠電壓80 V、濃縮膠電壓120 V，電泳時(shí)間90 min），然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（電流300 mA;轉(zhuǎn)模時(shí)間根據(jù)蛋白分子量決定，一般1 kDa轉(zhuǎn)膜1 min）;用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入內(nèi)參蛋白β-actin和各目的蛋白一抗（β-actin稀釋比例為1 ∶ 6 000，目的蛋白稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次、每次10 min，加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 8 000），室溫靜置1 h;TBST洗膜3次、每次10 min，涂抹ECL發(fā)光液并觀察蛋白質(zhì)條帶，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，然后使用Image J V1.8.0軟件分析條帶灰度值。分別以p-JAK2與JAK2、p-STAT3與STAT3蛋白條帶灰度值的比值表示JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，以Bcl-2、Bax蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Graph Pad Prism 7軟件作圖。數(shù)據(jù)采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊性）或 Dunnett’s T3 檢驗(yàn)（方差不齊性）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 沒食子醇提物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)12、24、48、72 h后，與空白對(duì)照組比較，5-FU組和0.05～0.5 mg/mL 沒食子醇提物組HCT-116、Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且沒食子醇提物的作用具有一定濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。沒食子醇提物處理HCT-116細(xì)胞12、24、48、72 h后的IC50分別為0.313、0.131、0.107、0.100 mg/mL，處理Caco-2細(xì)胞12、24、48、72 h后的IC50分別為1.093、0.404、0.246、0.134 mg/mL。各組細(xì)胞的增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 沒食子醇提物對(duì)細(xì)胞遷移的影響

與空白對(duì)照組比較，5-FU組和0.1、0.3、0.5 mg/mL沒食子醇提物組2種細(xì)胞的劃痕愈合率均顯著降低（P<0.05），表明細(xì)胞遷移受到了抑制，且沒食子醇提物的作用具有一定濃度依賴趨勢(shì)。各組細(xì)胞的劃痕愈合率測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 沒食子醇提物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

與空白對(duì)照組比較，Rosup組和0.1、0.3、0.5 mg/mL 沒食子醇提物組2種細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著升高（P<0.05），且沒食子醇提物的作用具有一定濃度依賴趨勢(shì)。各組細(xì)胞中ROS的熒光檢測(cè)圖見圖1，ROS熒光強(qiáng)度百分比測(cè)定結(jié)果見表3。

3.4 沒食子醇提物對(duì)細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平的影響

與空白對(duì)照組比較，5-FU組和0.1、0.3、0.5 mg/mL沒食子醇提物組2種細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05），且沒食子醇提物的作用具有一定濃度依賴趨勢(shì)。各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平測(cè)定結(jié)果見表4。

3.5 沒食子醇提物對(duì)細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，5-FU組和0.1、0.3、0.5 mg/mL沒食子醇提物組2種細(xì)胞中JAK2、STAT3磷酸化水平和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且沒食子醇提物的作用具有一定濃度依賴趨勢(shì)。各組細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，JAK2、STAT3磷酸化水平和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表5。

4 討論

5-FU是抗嘧啶類化療藥物，進(jìn)入體內(nèi)活化成脫氧核苷酸后，通過與胸苷酸合成酶結(jié)合并抑制此酶的活性，導(dǎo)致脫氧胸苷酶缺乏和DNA復(fù)制障礙，尤其對(duì)消化道腫瘤效果明顯[12]。以5-FU為主的mFOLFOX6方案為目前公認(rèn)治療結(jié)腸癌的一線用藥方案，因此本研究選擇5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照藥，同時(shí)選擇結(jié)腸癌細(xì)胞中具有代表性的HCT-116細(xì)胞（惡性程度較高）和Caco-2細(xì)胞（惡性程度較低）為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平上探討沒食子醇提物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效果。

腫瘤細(xì)胞能夠通過失控性增殖以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方式侵犯周圍組織和器官，引起器官破壞和正常細(xì)胞功能損害，使機(jī)體功能失調(diào)，從而威脅生命。抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是控制癌癥進(jìn)展的重要途徑[13-14]。因此，本研究首先檢測(cè)沒食子醇提物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制情況，發(fā)現(xiàn)隨著沒食子醇提物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈升高趨勢(shì)，遷移率呈降低趨勢(shì)，故本研究初步判斷沒食子醇提物能夠有效抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。

炎癥微環(huán)境是導(dǎo)致癌癥發(fā)生與進(jìn)展的另一個(gè)重要因素。腫瘤細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境中存在大量的炎癥因子，其中具有代表性的包括IL-6、TNF-α等，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起到正向調(diào)控作用，并誘導(dǎo)腫瘤血管及淋巴管的生成，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[15]。本研究中，在沒食子醇提物作用之后細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平顯著降低，說明其改變了結(jié)腸癌細(xì)胞賴以生存的炎癥環(huán)境，可使癌細(xì)胞的代謝減慢。

JAK2/STAT3信號(hào)通路被認(rèn)為是“炎-癌轉(zhuǎn)變”機(jī)制當(dāng)中的一條重要信號(hào)軸，該通路中的JAK2和STAT3蛋白在腫瘤發(fā)生過程中起到重要調(diào)控作用[16-19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)沒食子醇提物干預(yù)后，在細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低的同時(shí)，細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值也顯著降低，即JAK2、STAT3蛋白的磷酸化水平顯著降低，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的p-STAT3減少，隨之引起細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax水平升高、抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降。以上在分子水平上發(fā)生的改變也證實(shí)了JAK2/STAT3信號(hào)通路可由其上游的炎癥因子激活。因此，抑制炎癥因子的表達(dá)能夠使JAK2/STAT3信號(hào)通路受到抑制，同時(shí)會(huì)影響調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族蛋白的正常表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[20-21]。

ROS是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體等細(xì)胞器內(nèi)發(fā)生的各種生化反應(yīng)中自然產(chǎn)生的高活性化學(xué)物質(zhì)，高濃度的ROS會(huì)通過內(nèi)源性和外源性途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性并促使細(xì)胞凋亡[22]。許多促氧化類化療藥物的作用原理就是將ROS水平提高到可以促使腫瘤細(xì)胞死亡的程度，即通過過度激活ROS引起腫瘤內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和凋亡[23]。也有文獻(xiàn)證實(shí)，ROS的過度活化可通過多種信號(hào)通路網(wǎng)間接抑制STAT3的表達(dá)[24-26]。本研究中，沒食子醇提物能夠增加結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)，且該作用具有濃度依賴趨勢(shì)，說明通過過度氧化應(yīng)激殺死腫瘤細(xì)胞也是沒食子醇提物的抗癌機(jī)制之一。

綜上所述，沒食子醇提物能夠增加結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS的積累，降低炎癥微環(huán)境中IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)降低JAK2/STAT3信號(hào)通路中JAK2、STAT3蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，最后達(dá)到抑制結(jié)腸癌的效果。本研究結(jié)果為闡明沒食子抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但仍需后續(xù)進(jìn)行更加深入的機(jī)制研究。

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（收稿日期：2021-10-08 修回日期：2021-12-21）

（編輯：林 靜）

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.2021D01C259）

碩士研究生。研究方向：天然藥物抗腫瘤作用機(jī)制。電話：0991-2110360。E-mail：965175578@qq.com

通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：天然藥物抗腫瘤作用機(jī)制。電話：0991-2110360。E-mail：896612093@qq.com