阿孜古麗·阿布都熱合曼,李宇翔,趙寰宇,朱麗萍

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高居我國女性惡性腫瘤中的第1 和第4位[1]。其中，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growthfactor receptor 2,HER2)均為陰性的乳腺癌,約占所有類型乳腺癌中的15%～20%[2]。TNBC 最常見的組織學(xué)類型為浸潤性導(dǎo)管癌，TNBC 細胞的增殖轉(zhuǎn)移不受雌激素及其受體調(diào)節(jié)，具有高度異質(zhì)性和侵襲性，預(yù)后較其他類型乳腺癌差。TNBC患者中位生存期約為13 個月[3]，即使接受乳腺癌根治性切除術(shù)及化療、放療綜合治療后的患者，也常于術(shù)后3 年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[4]。因此，早診斷早治療對患者的預(yù)后具有極其重要的意義。

溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein,LAMP)家族是類高度糖基化的跨膜蛋白，包括LAMP1、LAMP2、LAMP3、CD68/Macrosialin/LAMP4、BAD-LAMP/LAMP5 五個成員。其位于溶酶體膜上，溶酶體是真核細胞中的酸性細胞器，最初被認為是唯一能將細胞內(nèi)和細胞外的大分子降解為可用的成分的細胞器[5-6]。直到通過不斷的研究才被認為是細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，越來越多的證據(jù)表明它們與神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等多種疾病有關(guān)[7]，也有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤存在著LAMP 異常表達，認為其LAMP 水平與腫瘤的嚴重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[8-9]。本研究分析溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（LAMP2）表達水平與臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，為三陰性乳腺癌的發(fā)生機制、預(yù)后評估及精準治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2015 年1 月-2017 年1 月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行乳腺癌根治術(shù)的104例TNBC 患者臨床及病理資料，對照組采用同一患者距腫瘤邊緣＞5 cm 的癌旁組織。104 例TNBC 患者均為女性，年齡35-72 歲，中位年齡54歲，Ⅰ期18 例，Ⅱ期55 例，Ⅲ期31 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 例。納入標準：①符合TNBC 診斷標準的女性患者；②所有組織標本均在離體2 min 內(nèi)在液氮及-80 ℃冷藏；③術(shù)后病理結(jié)果為浸潤性導(dǎo)管癌；④術(shù)前未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療。排除標準：①非原發(fā)性腫瘤；②伴有其他部位的惡性腫瘤；③臨床資料缺失或失訪。本研究得到了新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法 收取104 對癌組織和癌旁組織，嚴格按照全蛋白提取試劑盒說明書，在冰上配制溶液和研磨組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進行裂解，12 000 g/min 離心20 min，留取上清制備蛋白溶液。按照BCA 試劑盒說明書進行標準平配制、稀釋和檢測完成蛋白濃度的測定，按照5×緩沖液:提取蛋白=1:4 加入緩沖液，在100 ℃下煮10 min 變性。按照BCA 測定結(jié)果加入SDS-PAGE 凝膠，恒流電泳,電泳完成后轉(zhuǎn)移到NC 膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗孵育過夜，TBST 清洗3 次,每次10 min，一抗孵育結(jié)束后，與特定濃度的二抗進行孵育結(jié)合。二抗帶HRP 或AP 標記。二抗回收用PBST 洗滌5min×5 次化學(xué)發(fā)光顯影，曝光/成像。純水洗滌5-7次，膜上滴加顯影液放置2-3min，曝光成像獲取圖片。Image J 分析蛋白的相對濃度后GraphPad Prism 8繪圖。

1.3 隨訪 采用定期門診復(fù)查、電話隨訪、入院復(fù)查記錄的方式進行隨訪，隨訪起始時間為患者術(shù)后出院時間，終止時間為死亡日期，截至2022年1月，中位隨訪時間為66 個月，所有患者均獲得有效隨訪資料。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，GraphPad Prism8.0 輔助作圖。連續(xù)性變量用中位數(shù)及四分位間距表示，組間差異采用配對樣本t檢驗進行比較。分類變量以各類別的例數(shù)和百分比表示，組間差異采用χ2檢驗進行分析。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，兩組間生存率的比較采用Log-rank檢驗進行。采用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP2 蛋白的表達在TNBC 患者癌組織、癌旁組織中的表達水平 使用Western-Blot 檢測采集的104對凍存組織樣本中LAMP2的表達水平，癌組織中LAMP2 的相對表達水平(1.581±0.412)高于癌旁組織(0.705±0.305)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.935，P＜0.05，圖1、圖2)。

圖1 LAMP2在4對腫瘤-癌旁組織中的表達（T,TNBC組織；N,癌旁組織；GAPDH 為內(nèi)參；4例代表性樣本）

圖2 104例TNBC組織及對應(yīng)的癌旁組織中LAMP2 蛋白的相對表達水平

2.2 LAMP2 表達水平與TNBC 患者臨床病理特征的關(guān)系 將104例TNBC患者按LAMP2相對表達水平分組，以LAMP2 在癌組織中相對表達水平均數(shù)1.581為界限值，高于均數(shù)的患者納入高表達組，低于均數(shù)為低表達組。TNBC組織中LAMP2高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.669，P=0.031)、組織學(xué)分級(χ2=8.847，P=0.003)、TNM分期(χ2=11.158，P=0.004)相關(guān)，LAMP2與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)無相關(guān)性。見表1。

表1 TNBC組織中LAMP2蛋白表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LAMP2 表達與TNBC 患者預(yù)后的關(guān)系 104例TNBC 患者中死亡32 例，5 年生存率為69.5%。其中，LAMP2 高表達組52 例，死亡21 例，5 年生存率為61.0%；低表達組52 例，死亡6 例，5 年生存率為89.9%，兩組間生存率存在顯著差異(P＜0.05，圖3)。Cox 比例風險回歸模型單因素分析顯示：腫瘤分期(P＝0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＝0.005)、LAMP2 表達水平(P＝0.005)與TNBC 患者OS顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期(HR:2.408；95%CI：1.323～4.382；P=0.004)、LAMP2表達(HR: 2.851；95%CI:1.311～6.200；P=0.008)是TNBC 患者OS 的獨立預(yù)測因素(表2)。

表2 三陰性乳腺癌患者總生存單因素分析

圖3 LAMP2高表達組和低表達組TNBC患者的生存分析曲線

表3 三陰性乳腺癌患者總生存多因素Cox回歸分析

3 討論

LAMP2是LAMP家族中的一員，屬于真核酸性細胞器溶酶體合成的蛋白，它最初被定義為參與細胞內(nèi)和細胞外大分子降解的小分子蛋白，近期文獻報道，認為它是維持細胞穩(wěn)定的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且有越來越多的證據(jù)證實它參與很多疾病的產(chǎn)生與發(fā)展，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及癌癥[8,9]。

多項研究表明，大多數(shù)LAMP2 蛋白存在于細胞核周的溶酶體和晚期核內(nèi)體中，而一小部分LAMP2 蛋白在質(zhì)膜、核內(nèi)體和溶酶體之間動態(tài)穿梭[10-11]。然而，一些學(xué)者認為在癌細胞中，特別是具有侵襲性表型的癌細胞中，溶酶體的分布轉(zhuǎn)變?yōu)閺暮酥芟蛲庵苣Ｊ睫D(zhuǎn)移，從而釋放溶酶體內(nèi)容物，促進其遷移，侵襲或轉(zhuǎn)移[12-15]。在乳腺癌的表型中，TNBC 具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率、年輕化、預(yù)后差等獨特的生物學(xué)特征，本研究通過對TNBC 患者癌組織、癌旁組織進行LAMP2 差異表達分析，并通過WB 實驗將LAMP2 相對表達量1.581 設(shè)為界限值，將患者分為高表達組與低表達組，通過患者臨床病理特征及預(yù)后分析，探討了其在TNBC 的表達對患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和生存預(yù)后的關(guān)系，進一步證實了LAMP2 在TNBC 中高表達可能代表著其更強的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力和更差的預(yù)后狀態(tài)。

中國的Li 和時帥等[16,17]進行了多種惡性腫瘤LAMP2 蛋白表達的研究，與正常組織相比，LAMP2蛋白在低分化的胃腺癌、肝細胞癌、唾液腺樣囊性癌以及肺腺癌患者支氣管肺泡灌洗液中也有較高的表達，預(yù)示著LAMP2 可能成為一個新的惡性腫瘤分子標記物。也有研究提示LAMP2 蛋白參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和演進過程[18]，該研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌和腺瘤中LAMP2 蛋白表達高于正常黏膜（P＜0.05），單因素生存分析結(jié)果為：血管浸潤、淋巴管浸潤、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移遠處轉(zhuǎn)移、、肝轉(zhuǎn)移、分化程度與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良呈現(xiàn)正相關(guān)。多因素風險回歸分析結(jié)果顯示浸潤深度和遠處轉(zhuǎn)移會縮短患者生存時間，是重要的危險因素。本研究課題組前期研究在乳腺癌差異基因拷貝數(shù)[19-20]以及富集基因分析中篩選出與TNBC 生物學(xué)行為高度相關(guān)的分子蛋白，其中LAMP2 在富集基因關(guān)系網(wǎng)中處于相對集中位置，推測LAMP2可能與TNBC 的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系。本研究結(jié)果示：在TNBC癌組織中LAMP2蛋白高表達，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及腫瘤學(xué)分期相關(guān)，也進一步佐證了LAMP2 蛋白可能參與了TNBC 的疾病發(fā)生和進展。本研究樣本量較少，無法完全代表TNBC 中LAMP2 的表達水平，后續(xù)進一步擴大樣本量后繼續(xù)研究，證明LAMP2是否能成為TNBC的一個新的分子標記物。

Ming等[21]研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中存在LAMP2高表達，其表達水平與食管癌患者生存預(yù)后相關(guān)，LAMP2 表達陽性的食管癌患者總生存率和疾病無進展生存率均顯著降低低表達者，提示LAMP2 與預(yù)后呈現(xiàn)負相關(guān)。本研究中對TNBC 患者進行了單因素、COX 多因素預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，LAMP2 高表達是TNBC 患者OS 的獨立危險因素(獨立預(yù)后因素)。在5 年的隨訪過程中104 例TNBC 患者中共死亡32例。其中，LAMP2 高表達組5 年生存率為61.0%；低表達組5 年生存率為89.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過對患者預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)LAMP2 表達越高可能代表著TNBC 患者預(yù)后水平更差。隨著分子特征、信號通路和機制在研究和臨床試驗中的廣泛研究，我們期待未來能找到更多有效的生物標志物和治療靶點用于TNBC患者的輔助治療。

綜上所述，LAMP2 在TNBC 癌組織中高表達，可能預(yù)示更高的腫瘤惡性度和不良預(yù)后。LAMP2有望成為TNBC 預(yù)后評估的新生物標志物和精準治療的新靶點。