齊慧慧，盧玉棟，章文賢*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350007； 2.福建師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院， 福建 福州 350007)

靈芝Ganodermalucidum是一種藥食兩用真菌，富含多糖、三萜、核苷和甾醇等生理活性物質(zhì)，其中三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝、抗菌、抗炎癥、降低血糖血脂、抗氧化[1-3]等功效，靈芝酸作為最具代表性的三萜化合物在藥用及功能食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，靈芝酸生產(chǎn)大部分源于靈芝發(fā)酵，產(chǎn)量不能滿足人們的需要，因此提高靈芝酸產(chǎn)量的研究成為靈芝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

近年來(lái)有研究表明，靈芝生長(zhǎng)和靈芝酸的代謝受中藥及其提取物、金屬離子、真菌激發(fā)因子和稀土元素等的影響[4-6]。朱強(qiáng)等[7]在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加甘草、山茱萸等中藥，發(fā)現(xiàn)甘草更利于促進(jìn)靈芝酸的合成，山茱萸同時(shí)促進(jìn)靈芝生長(zhǎng)和靈芝多糖合成。鮑銳[8]在靈芝培養(yǎng)過(guò)程中分別添加硫酸銅和氯化鈣，將靈芝酸產(chǎn)量提高了57%和29%。高興喜等[9]以木素木霉、蘑菇輪枝孢和頂頭孢為激發(fā)子菌株，采用脫脂脫蛋白酸解法制備真菌激發(fā)子，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期添加頂頭孢激發(fā)子可將靈芝酸產(chǎn)量提高5.2倍，在發(fā)酵后期添加木素木霉激發(fā)子可將靈芝酸產(chǎn)量提高4.0倍。

目前在靈芝培養(yǎng)過(guò)程中添加生物質(zhì)的研究較少，尚未報(bào)道過(guò)在靈芝培養(yǎng)基中添加油茶籽殼的研究。另有研究表明，油茶籽殼作為碳源能夠促進(jìn)茶樹菇、平菇和杏鮑菇的菌絲體生長(zhǎng)[10]。此外，多種外源添加物對(duì)靈芝酸代謝都有顯著影響。因此本研究在靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中添加不同濃度的油茶籽殼提取液，探究油茶籽殼提取液在靈芝液體靜置培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)以及靈芝酸代謝的影響，以期為油茶籽殼的高價(jià)值化和靈芝液體靜置培養(yǎng)提供借鑒和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種和材料

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst，由福建師范大學(xué)國(guó)家教育部工業(yè)微生物研究工程中心保藏提供。

油茶籽殼均來(lái)自福建省永泰縣山茶油加工廠，選用新鮮干燥，無(wú)霉變無(wú)蟲蛀的油茶籽殼，經(jīng)過(guò)預(yù)處理粉碎成長(zhǎng)寬厚為(0.3～0.6)cm×(0.3～0.6)cm×(0.1～0.15)cm的顆粒。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì)

(1)PDA固體培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3.0 g，去離子水1 L，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖35 g，蛋白胨5.0 g，酵母精粉2.5 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(3)深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35 g，蛋白胨5.0 g，酵母精粉5.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(4)油茶籽殼深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：以基礎(chǔ)深層培養(yǎng)基(不添加油茶籽殼提取液)為對(duì)照，油茶籽殼提取液原液在培養(yǎng)基中的配比分別設(shè)置為10%、20%、50%和100%。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1油茶籽殼提取液制備 將預(yù)處理后的油茶籽殼用破碎機(jī)打成粉末，過(guò)60目篩，油茶籽殼粉與蒸餾水1∶9的比例煮沸30 min，紗布過(guò)濾制成油茶籽殼提取液原液。

1.3.2斜面培養(yǎng) 用接種鏟將保藏在PDA試管中的靈芝菌絲切下一小塊放入新配制的PDA斜面的試管中，30℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長(zhǎng)滿斜面。

1.3.3種子液體培養(yǎng) 在PDA斜面試管中加入10 mL無(wú)菌水，用接種鏟刮下白色菌絲體倒入種子培養(yǎng)基中。在30℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。

1.3.4液體深層發(fā)酵培養(yǎng) 吸取20 mL靈芝菌絲接入深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種濃度設(shè)置3組平行。在30℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。

1.3.5液體靜置培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng)4 d后，轉(zhuǎn)移到平板中，每個(gè)平板接入25 mL，30 ℃恒溫暗培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將上層白色菌絲體取出，蒸餾水沖洗背面，收集備用。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1靈芝菌絲體生物量的測(cè)定 將液體靜置培養(yǎng)收集的上層白色菌絲體，放置于平板中，50℃烘干至恒重后稱重。再在研缽中充分研磨成粉末，裝在 5 mL的離心管中保存在 4℃的冰箱中備用。

1.4.2發(fā)酵液中殘?zhí)呛康臏y(cè)定 將發(fā)酵液離心取上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，利用葡萄糖氧化酶作為催化劑反應(yīng)的原理，利用葡萄糖生物傳感分析儀測(cè)定氧含量變化，由此得到葡萄糖的濃度。

1.4.3總靈芝酸含量的測(cè)定 因齊墩果酸和靈芝酸都是三萜類化合物，且化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此用齊墩果酸來(lái)繪制總靈芝酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)方法采用高氯酸-香草醛顯色法[11]。

1.4.4靈芝酸單體的測(cè)定 樣品前處理，稱取1.4.1步驟得到的靈芝菌絲體粉末100 mg，于2 mL的離心管中，加入1 mL70%乙醇，超聲處理30 min，靜置30 min，重復(fù)3次，離心收集上清液；重復(fù)上述步驟，將3次離心收集到的上清液烘干。將烘干后的樣品用1 mL色譜級(jí)甲醇溶解，再用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾到樣品瓶中。用高效液相色譜檢測(cè)靈芝酸單體。HPLC檢測(cè)條件為:HPLC色譜柱為C18柱 ( Kromasil 100-5-C8，4.6×250 mm，5μm);進(jìn)樣量20 μL;流速1 mL·min-1;流動(dòng)相A為甲醇/乙酸(100∶0.5=V∶V)，流動(dòng)相B為超純水;0～20 min，A相為80%～100%，B相為0～20%梯度洗脫;20～30 min，A相為100%，B相為0洗脫;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm;柱溫為30℃;洗脫時(shí)間為30 min。記錄相應(yīng)的峰面積和出峰時(shí)間。計(jì)算出各個(gè)靈芝酸單體的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)形態(tài)的影響

由圖1可知，添加10%和20%油茶籽殼提取液靈芝菌絲直徑始終大于對(duì)照組，添加50%和100%的則小于對(duì)照組。這表明低濃度油茶籽殼提取液有利于靈芝菌絲擴(kuò)張，高濃度油茶籽殼提取液會(huì)抑制靈芝菌絲的向外生長(zhǎng)，但高濃度的油茶籽殼提取液促使菌絲生長(zhǎng)更加密壯。

圖1 油茶籽殼對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)形態(tài)的影響Fig.1 Effect of camellia seed shell on the growth morphology of Ganoderma lucidum mycelia

2.2 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體生物量的影響

從圖2可知，靈芝菌絲體生物量從靜置培養(yǎng)開始隨時(shí)間不斷增加，前6 d生物量增加較快，從第6 d之后進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)期，生物量積累較慢。在第6 d，對(duì)照組菌絲體生物量為16.7 g·L-1，添加10%、20%和50%油茶籽殼提取液的分別達(dá)到了19.2、21.3和16.5 g·L-1，添加100%油茶籽殼提取液為13.3 g·L-1，表明添加100%油茶籽殼提取液對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，添加低濃度的油茶籽殼提取液對(duì)菌絲體生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用。

圖2 油茶籽殼對(duì)靈芝菌絲體生物量的影響Fig.2 Effect of camellia seed shell on the biomass of Ganoderma lucidum mycelia

2.3 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵液中殘?zhí)呛康挠绊?/h3>

由圖3可知，靈芝菌絲體發(fā)酵液中葡萄糖含量隨著時(shí)間的增加逐漸減少，前6 d的葡萄糖消耗速度較快，在第9 d基本耗盡。從整體趨勢(shì)分析，添加不同濃度的油茶籽殼提取液能夠不同程度地提升靈芝菌絲體對(duì)葡萄糖的利用能力。

圖3 油茶籽殼提取液對(duì)葡萄糖消耗的影響Fig.3 Effect of camellia seed shell extract on the glucose consumption

2.4 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體總靈芝酸含量和產(chǎn)量的影響

由圖4A可知，添加20%、50%、100%油茶籽殼提取液的總靈芝酸含量在第9 d達(dá)到最高，分別為5.11、6.64和7.97 mg·dg-1，是對(duì)照組的1.29、1.67和2.01倍，而添加10%油茶籽殼提取液的靈芝酸含量只有對(duì)照的93%?？梢?jiàn)高濃度油茶籽殼提取液對(duì)靈芝酸的積累有促進(jìn)作用。由圖4B可知，添加10%和20%油茶籽殼提取液的總靈芝酸產(chǎn)量略低于對(duì)照組。而50%和100%油茶籽殼提取液使總靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到了1 406.37和1 599.73 mg·L-1，分別為對(duì)照組的1.34和1.52倍。

注：A為總靈芝酸含量；B為總靈芝酸產(chǎn)量圖4 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體總靈芝酸含量的影響Fig.4 Effect of camellia seed shell extract on the total content of ganoderic acid in Ganoderma lucidum mycelia

2.5 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體4種靈芝酸單體含量的影響

由圖5可知，靈芝菌絲體4種靈芝酸單體的合成在高濃度提取液下都表現(xiàn)出了促進(jìn)作用：添加50%油茶籽殼提取液的靈芝酸單體GA-Mk、GA-T、GA-S 和GA-Me含量在第9 d分別達(dá)到505.973、604.133、369.268和255.967 ug·dg-1，相較于對(duì)照組，分別提高了的16.05%、5.5%、32.5%和67.1%。添加100%油茶籽殼提取液的靈芝酸單體GA-Mk、GA-T、GA-S 和GA-Me含量在第9 d分別達(dá)到557.327、599.355、418.773和274.443 ug·dg-1，相較于對(duì)照組，分別提高了的27.83%、4.7%、50.3%和79.2%。可見(jiàn)在較高濃度范圍內(nèi)，4種靈芝酸單體的含量隨著油茶籽殼提取液濃度的增高而增高。

圖5 油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體靈芝酸單體含量的影響Fig.5 Effect of camellia seed shell extract on the content of ganoderic acid monomer in Ganoderma lucidum mycelia

3 結(jié)論與討論

油茶籽殼作為常見(jiàn)的廢棄生物質(zhì)材料之一，其中包含粗蛋白、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、還原糖、粗脂肪和灰分等多種成分[12]，將其高價(jià)值化對(duì)環(huán)境保護(hù)和能源高效利用都具有意義。因此，本試驗(yàn)用不同濃度油茶籽殼提取液對(duì)靈芝進(jìn)行液體靜置培養(yǎng)，結(jié)果表明，添加高濃度的油茶籽殼提取液對(duì)靈芝的生長(zhǎng)具有一定抑制作用，較低濃度的油茶籽殼提取液對(duì)靈芝的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。靈芝菌絲體發(fā)酵液的pH隨著發(fā)酵過(guò)程不斷降低，油茶籽殼提取液的添加并無(wú)影響。添加50%和100%濃度油茶籽殼提取液對(duì)靈芝菌絲體總靈芝酸含量和產(chǎn)量均有明顯提升作用，相較于對(duì)照組，它們的含量分別提升了67%和101%，產(chǎn)量分別提升了34%和52%。4種靈芝酸單體GA-Mk、GA-S、GA-T和GA-Me的生成同樣受到高濃度油茶籽殼提取液的促進(jìn)，100%濃度的油茶籽殼提取液將靈芝酸單體GA-S和GA-Me的含量都提高了50%以上；而低濃度的油茶籽殼提取液(10%和20%濃度)則具有相反的抑制作用。

此前有研究報(bào)道，油茶籽殼中還含有總黃酮、花青素、多糖、茶皂素、木糖醇等物質(zhì)[12]。在其他食用菌中如猴頭菇，香菇，小白菇和黑木耳等食用菌中都發(fā)現(xiàn)一定濃度的茶皂素對(duì)其菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[13-14]，由此推斷高濃度提取液條件下的生長(zhǎng)抑制或許是由茶皂素導(dǎo)致的。靈芝酸的代謝往往受逆境因素的影響，油茶籽殼中的抑菌因子可能反而誘導(dǎo)靈芝酸的合成。另?yè)?jù)裴海生等[15]的研究，木質(zhì)素作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)的靈芝多糖含量和總?cè)坪烤刑岣?，油茶籽殼中的木質(zhì)素也可能是本研究中靈芝酸含量提高的原因。由此可見(jiàn)，油茶籽殼作為靈芝的培養(yǎng)基質(zhì)具有一定應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也是提高靈芝酸產(chǎn)量的一種有效方法。