趙娜 ，何曉旭 ，賈磊，朱春華，張博*

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300457；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.天津市農(nóng)學(xué)院，天津 300384)

1 引言

動(dòng)物體色具有迷惑或躲避天敵等自我保護(hù)功能，不同體色對(duì)魚(yú)類的生存也有著特殊的意義。魚(yú)類在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中體色的變化主要受遺傳因素的影響，此外，外部環(huán)境[1-3]、飼料營(yíng)養(yǎng)[4]和神經(jīng)內(nèi)分泌物[5-7]也會(huì)影響魚(yú)類的體色變化[8-9]。多數(shù)色素細(xì)胞的遺傳是保守的[10-11]，如一些與色素相關(guān)的基因先后在小鼠（Mus musculus）的皮膚和斑馬魚(yú)（Danio rerio）的皮膚中均有發(fā)現(xiàn)，而mitf、tyr、dct、sox10和ednr等[12-15]基因在皮膚中的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)特征也非常相似。此外，在硬骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的slc24a5基因也參與哺乳動(dòng)物體色或毛發(fā)中色素細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育[16]。在魚(yú)類體色生成過(guò)程中，黑色素的產(chǎn)生和擴(kuò)散起主導(dǎo)作用，其中酪氨酸酶基因家族中的酪氨酸酶（TYR）是主效基因[17]。TYR 受多個(gè)基因控制，酪氨酸酶受體基因1（tyr1）、性別決定區(qū)Y-box 10 基因（sox10）[18]、多巴素異構(gòu)酶基因（dct）[19]、黑皮質(zhì)素受體-1（mcir）對(duì)酪氨酸酶的產(chǎn)生均具有調(diào)節(jié)作用[20-22]。

研究表明，飼養(yǎng)密度[23]、水溫[24]、光照強(qiáng)度[24]能顯著地影響比目魚(yú)（Pleuronectiformes）無(wú)眼側(cè)黑化的發(fā)生?？茖W(xué)的養(yǎng)殖管理方法如營(yíng)養(yǎng)成分的攝入控制和親本篩選[25]也能有效地減少比目魚(yú)體色異常的發(fā)生。Nakamura 等[26]認(rèn)為，缺乏光敏物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致黑色素合成不足，如核黃素、類胡蘿卜素、維生素A 和維生素D，而核黃素被認(rèn)為是其中最重要的因素。研究表明[27]，牙鲆（Paralichthysolivaceus）的白化病是視紫紅質(zhì)缺乏的結(jié)果，其產(chǎn)生依賴于DHA。而Devresse 等[28]認(rèn)為，色素沉著似乎與DHA 無(wú)關(guān)，而是與DHA 和二十碳五烯酸的比例有關(guān)。胰蛋白酶、維甲酸相關(guān)酶、維甲酸受體及其結(jié)合受體（TR、VDR、PPAR 等）的突變及其對(duì)仔魚(yú)色素細(xì)胞分化的調(diào)控，可能影響魚(yú)體兩側(cè)色素細(xì)胞的命運(yùn)，進(jìn)而影響體細(xì)胞色素異常[29-30]。不同環(huán)境背景色養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，條斑星鰈（Verasper moseri）在淺色養(yǎng)殖環(huán)境下mch-R2的mRNA 表達(dá)量低于黑色養(yǎng)殖環(huán)境，但是兩種環(huán)境中mch-R1的mRNA 沒(méi)有變化，表明了mch-R2參與了不同環(huán)境背景下體色變化過(guò)程，mch-R可能對(duì)黑色素聚集激素（MCH）有抑制調(diào)節(jié)作用[31]。無(wú)眼側(cè)黑化消褪的牙鲆垂體MCH mRNA表達(dá)水平顯著高于無(wú)眼側(cè)黑化個(gè)體，同時(shí)與無(wú)眼側(cè)正常個(gè)體無(wú)顯著差異，表明了MCH 及其基因均參與了無(wú)眼側(cè)黑化消褪的調(diào)控過(guò)程[32]。在魚(yú)類中，tyr基因突變導(dǎo)致青鳉（Oryzias latipes）的黑色素細(xì)胞異常，皮膚呈現(xiàn)橙色[33]。虹鱒魚(yú)（Oncorhynchusmykiss）中的tyr基因突變顯示嵌合白化（偽白化）和完全白化現(xiàn)象[34]。黃顙（Pelteobagrus fulvidraco）的tyr基因突變則顯示黑色素缺乏，呈現(xiàn)體色部分白化[35]。綜上所述，遺傳和環(huán)境因素的相互作用影響了魚(yú)類的體色異常。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)高比例體色異常的苗種，即無(wú)眼側(cè)出現(xiàn)黑色素的黑化現(xiàn)象[36-37]，主要表現(xiàn)為無(wú)眼側(cè)部分覆蓋斑塊色素，有時(shí)甚至完全呈黑底，不同的養(yǎng)殖環(huán)境會(huì)存在不同程度的黑化現(xiàn)象。體色異常極大地影響半滑舌鰨的銷售價(jià)格，長(zhǎng)期困擾養(yǎng)殖企業(yè)，卻一直未能得到有效解決[38]。針對(duì)半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化，影響體色變化的新基因有待挖掘和鑒定。轉(zhuǎn)錄組是目前研究基因表達(dá)的重要手段，是篩選新功能基因的有效方法。本文選取半滑舌鰨體色異常皮膚樣本和正常皮膚樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的比較分析。以期找出與半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化相關(guān)的表達(dá)顯著變化的功能基因，為半滑舌鰨體色異常的機(jī)制提供分子水平的理論支持。

2 材料和方法

2.1 魚(yú)類取樣準(zhǔn)備

從天津乾海源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司獲得3 尾無(wú)眼側(cè)黑化的工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨，平均體重為（0.61±0.02）kg，平均體長(zhǎng)為（28.2±0.1）cm。用濃度為120 mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）（北京格林恒興生物科技有限公司）將魚(yú)麻醉后，使用滅菌的手術(shù)剪和鑷子剪開(kāi)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的皮膚并采集樣本，獲取無(wú)眼側(cè)色素沉著的皮膚組織和非色素沉著的正常皮膚組織（圖1），并在-80℃下保存，直至提取RNA。

圖1 半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化魚(yú)體色特征Fig.1 The body color feature of the Cynoglossus semilaevis with no eye side blackened fish

2.2 RNA 測(cè)序、數(shù)據(jù)過(guò)濾及生物信息學(xué)分析

使用Trizol 試劑（日本Takara）提取總RNA。安捷倫2100 生物分析儀（安捷倫科技公司，美國(guó)圣克拉拉）用于評(píng)估RNA 質(zhì)量和濃度。無(wú)眼側(cè)黑化皮膚組織中的樣品標(biāo)記為csc1、csc2 和csc3；正常皮膚樣品標(biāo)記為csh1、csh2 和csh3。測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq?2500（Illumina 公司，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國(guó)）。用帶Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，再以片段化后的mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA 第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs（A、U、G、C）、核糖核酸酶H 和DNA 聚合酶I 合成cDNA 第二鏈；再經(jīng)過(guò)磁珠純化并加EB 緩沖液洗脫，對(duì)洗脫之后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，然后用磁珠進(jìn)行片段大小選擇、降解含U 鏈，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。根據(jù)物種的參考基因組和基因信息（GCA_000523025.1），將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上。獲得過(guò)濾后數(shù)據(jù)后，將其與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲取測(cè)得條目的定位信息。

2.3 差異表達(dá)分析和樣品相關(guān)性分析

用bowtie2 軟件將過(guò)濾后數(shù)據(jù)比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄本序列，而后利用RSEM 軟件，調(diào)用bowtie2 的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)轉(zhuǎn)錄本上的測(cè)得條目數(shù)目，并對(duì)其進(jìn)行FPKM 轉(zhuǎn)換。FPKM 是指每百萬(wàn)測(cè)得片段中來(lái)自某一基因平均每1 000 堿基長(zhǎng)度的測(cè)得片段數(shù)目，其同時(shí)考慮了測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)測(cè)得片段計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。用R 語(yǔ)言包edgeR 進(jìn)行差異分析，篩選閾值為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）小于0.05，log2FC（FC 為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組可測(cè)量比值）大于1 或log2FC 小于-1。利用皮爾森相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達(dá)模式的相似度越高。相關(guān)性系數(shù)是介于-1～1 之間的實(shí)數(shù)，當(dāng)相關(guān)性系數(shù)介于-1～0 時(shí)，表明變量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；當(dāng)相關(guān)性系數(shù)介于0～1 時(shí)，表明變量之間存在正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)相關(guān)性系數(shù)為0 時(shí)，二者之間不存在相關(guān)性。

2.4 差異基因GO 和KEGG 富集及功能篩選

根據(jù)分析目的篩選出差異基因后，研究差異基因在Gene Ontology（簡(jiǎn)稱GO，http://www.geneontology.org/）中的分布狀況。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)。通路顯著性富集分析以KEGG 通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出差異基因相對(duì)于所有有注釋的基因顯著富集的通路。GO 富集分析方法為Hyper-geometric 分布，與KEGG 富集分析方法一樣，我們選取FDR≤0.05的GO 條目作為顯著富集的GO 條目。FDR≤0.05 的通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路。我們挑選了富集最顯著的20 條通路，繪制差異表達(dá)基因KEGG 富集散點(diǎn)圖。KEGG 富集程度通過(guò)富集因子、Qvalue 和富集到此通路上的基因個(gè)數(shù)來(lái)衡量。其中富集因子指該通路中富集到的差異基因個(gè)數(shù)與注釋基因個(gè)數(shù)的比值。富集因子越大，表示富集的程度越大。Qvalue 是做過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的Pvalue，Qvalue 的取值范圍為0～1，越接近0，表示富集越顯著。差異基因功能篩選集中于比目魚(yú)體色異常的相關(guān)6 條代謝通路，這6 條KEGG 代謝通路如下：花生四烯酸代謝通路、甲狀腺激素合成通路、光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、黑色素生成通路、視黃醇代謝通路和PPAR 信號(hào)通路。

2.5 候選基因的qPCR 定量驗(yàn)證

用qPCR 方法檢測(cè)黑化魚(yú)正常皮膚樣本（csh1、csh2 和csh3）和黑化皮膚樣本（csc1、csc2 和csc3）中的候選mRNA 的表達(dá)。采用北京百奧創(chuàng)新科技有限公司核酸提取試劑盒和PowerUp-SYBR-Green-Master-Mix 進(jìn)行mRNA 提取和qPCR。在42℃加熱2 min，在冰浴中孵育2 min，加入提取RNA 的試劑，在42℃加熱15 min，提取總RNA，然后在85℃下保持5 min。將RNA 儲(chǔ)存在-80℃下。cDNA 合成按照PrimeScript?RT reagent Kit 試劑盒操作方法進(jìn)行，cDNA 儲(chǔ)存在-20℃下備用。使用QuantStudio6 Flex 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國(guó)加利福尼亞州賽默飛世爾科學(xué)公司）在96 孔板中進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體積為20 μL：AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix (Without ROX) 10.0 μL，Primer 1(10 μmol/L) 0.4 μL，Primer 2 (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.2 μL，配制過(guò)程在冰上完成。反應(yīng)程序包括：50℃預(yù)熱2 min，95℃預(yù)熱2 min，隨后在95°C 下，持續(xù)30 s，58°C 持續(xù)30 s，95°C 持續(xù)15 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。選擇β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平作為正?；膬?nèi)源性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，并使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 RNA-seq 數(shù)據(jù)披露

通過(guò)RNA-seq，6 個(gè)樣本共產(chǎn)生416 464 144 個(gè)過(guò)濾后數(shù)據(jù)，平均數(shù)據(jù)量在10 G 左右（9 208～11 897 M），Q20 和Q30 分別在92%和97%左右。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，6 個(gè)樣品的測(cè)序質(zhì)量良好，數(shù)據(jù)量充足，詳細(xì)數(shù)據(jù)如表1 所示，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，數(shù)據(jù)獲取編號(hào)為（PRJNA665385）。

表1 6 個(gè)半滑舌鰨皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品過(guò)濾后數(shù)據(jù)產(chǎn)出及質(zhì)控分析Table 1 Clean reads output and quality control analysis of six Cynoglossus semilaevis skin transcriptome sequencing samples

對(duì)兩組6 個(gè)樣品的RNA-seq 的過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)，6 個(gè)樣品的過(guò)濾后數(shù)據(jù)數(shù)量分布在30 772 761～39 743 985 之間，唯一比對(duì)到參考基因組上的測(cè)得條目百分比分布在76.47%～81.36%之間，不能比對(duì)到參考基因組的測(cè)得條目數(shù)目（雙端統(tǒng)計(jì)）普遍低于20%（表2）。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明6 個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量過(guò)關(guān)，可作進(jìn)一步分析。

表2 6 個(gè)半滑舌鰨皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Genomic comparison statistics of six Cynoglossus semilaevis skin transcriptome sequencing samples

3.2 差異表達(dá)分析及樣品相關(guān)性分析

csc1、csc2 和csc3 樣本之間的相關(guān)系數(shù)處于0.97～1之間，接近1，表明變量之間存在正相關(guān)關(guān)系，樣品之間表達(dá)模式為強(qiáng)相關(guān)。csh1、csh2 和csch3 樣本之間的相關(guān)系數(shù)處于0.76～1 之間，表明變量之間存在正相關(guān)關(guān)系，樣品之間表達(dá)模式為強(qiáng)相關(guān)，但是相關(guān)性弱于csc 樣本。csc1、csc2 和csc3 樣本和csh1、csh2和csch3 樣本的相關(guān)系數(shù)處于0.18～0.45 之間，表明變量之間存在正相關(guān)關(guān)系，樣品之間表達(dá)模式處于弱相關(guān)和中度相關(guān)（圖2）。

圖2 測(cè)序樣品相關(guān)性分析熱圖Fig.2 Correlation analysis heat map of sequencing samples

圖3a 顯示，樣本無(wú)眼側(cè)黑化皮膚csc1、csc2、csc3和無(wú)眼側(cè)正常皮膚csh1、csh2、csch3 之間差異基因總數(shù)1 665 個(gè)，其中上調(diào)基因497 個(gè)，下調(diào)基因1 168 個(gè)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到黑化半滑舌鰨的無(wú)眼側(cè)正常和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚的轉(zhuǎn)錄組序列信息，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析共得到837 540 個(gè)位點(diǎn)，其中A/G、C/G、C/T、G/A之間轉(zhuǎn)換數(shù)量最多。通過(guò)圖3b 也可以觀察到，csc與csh 兩組之間部分基因的表達(dá)量存在明顯差異（圖3）。

圖3 半滑舌鰨正常皮膚與黑化皮膚樣品間差異表達(dá)基因火山圖和差異表達(dá)基因豐度熱圖Fig.3 Volcano map of the number of differentially expressed genes and heat map of abundance of differentially expressed gene between normal and hypermelanotic skin samples of Cynoglossus semilaevis

3.3 差異表達(dá)基因的GO 及 KEGG 富集分析及體色功能差異基因篩選

對(duì)無(wú)眼側(cè)黑化組和無(wú)眼側(cè)正常組皮膚進(jìn)行GO富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在生物過(guò)程水平上差異基因主要富集在細(xì)胞過(guò)程、信號(hào)組織過(guò)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)控、生物學(xué)過(guò)程這5 個(gè)GO 通路；在細(xì)胞組分上主要富集在膜、細(xì)胞、細(xì)胞組分、膜組分、細(xì)胞器這5 個(gè)GO 通路；在細(xì)胞功能上主要富集在連接、催化活性這2 個(gè)GO 通路（圖4a）。由KEGG 富集散點(diǎn)圖（圖4b）可見(jiàn)，無(wú)眼側(cè)黑化和無(wú)眼側(cè)正常皮膚表達(dá)差異顯著的基因參與的通路主要有：丙酮酸代謝、C5-支鏈二元酸代謝、甲烷代謝及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等。

圖4 半滑舌鰨正常與黑化皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異基因富集注釋的GO 通路和KEGG 通路Fig.4 GO pathways and KEGG pathways analysis of differential expressed genes enrichment annotations of transcriptome sequencing of normal and hypermelanotic skin of Cynoglossus semilaevis

3.4 定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果

從轉(zhuǎn)錄組富集結(jié)果中選取的6 條KEGG 代謝通路如下：花生四烯酸代謝通路、甲狀腺激素合成通路、光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、黑色素生成通路、視黃醇代謝通路和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路。在以上6 條通路中選取差異最顯著的前10 個(gè)基因進(jìn)行定量表達(dá)驗(yàn)證。對(duì)黑化半滑舌鰨皮膚中差異表達(dá)基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平定量分析發(fā)現(xiàn)，黑化半滑舌鰨皮膚差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq 定量結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。針對(duì)6 個(gè)測(cè)序樣本，對(duì)6 個(gè)候選體色相關(guān)mRNA 定量qPCR 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果繪制箱線圖（圖5）。其中5 個(gè)基因txndc、alox15b、ptgs2、ptgis、atp1a2a在兩組樣本中均有顯著差異（p＜0.05），且有4 個(gè)基因在黑化組中表達(dá)均高于對(duì)照組，只有atp1a2a表達(dá)在黑化組表達(dá)較低，而acbd7基因則在兩組中無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

圖5 6 個(gè)候選體色相關(guān)mRNA 在半滑舌鰨6 個(gè)測(cè)序樣品中的qPCR 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果箱線圖Fig.5 Box plot of qPCR expression results of 6 candidate body color-related mRNAs in 6 sequencing samples of Cynoglossus semilaevis

4 討論

色素的異常沉著是比目魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的一個(gè)主要問(wèn)題，體色異常顯著降低了比目魚(yú)的市場(chǎng)價(jià)值[39]。近年來(lái)，關(guān)于半滑舌鰨體色異常的研究多有文獻(xiàn)報(bào)道[40-41]，其主要集中于已知體色調(diào)控基因的表達(dá)模式、著色劑飼料增色效果、理化因子對(duì)體色的影響等[42-43]，而從組學(xué)角度挖掘半滑舌鰨體色調(diào)控新基因的研究則比較缺乏。本研究運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)黑化半滑舌鰨的皮膚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，得到了半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化皮膚組織和非色素沉著的正常皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從6 條代謝通路（花生四烯酸代謝通路、甲狀腺激素合成通路、光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、黑色素生成通路、視黃醇代謝通路和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路）中篩選出半滑舌鰨體色異常相關(guān)的差異基因，為今后半滑舌鰨進(jìn)行體色異常排查提供了參考。選取其中差異最顯著的10 個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)差異基因與測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)相一致，分別為txndc、alox15b、ptgs2、ptgis、atp1a2a，且前4 個(gè)基因均在黑化組中上調(diào)，只有atp1a2a在黑化組中下調(diào)表達(dá)，暗示了這5 個(gè)差異基因可能參與了無(wú)眼側(cè)皮膚黑化的調(diào)控。

TXNDC 是含硫氧還原蛋白，此基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的二硫鍵異構(gòu)酶家族成員，該酶催化蛋白質(zhì)折疊和巰基-二硫鍵互換反應(yīng)。硫氧還原蛋白5（TXNDCS），是近年發(fā)現(xiàn)的PDI 家族成員之一，具有抗凋亡、抗氧化損傷和促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管形成、參與細(xì)胞炎癥、能量代謝等多種生物功能[44-45]。ALOX15B 是花生四烯酸15 脂氧合酶，編碼該酶的基因編碼參與脂肪酸氫過(guò)氧化物生產(chǎn)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的非血紅素鐵雙加氧酶的脂氧合酶家族成員，其所編碼的蛋白質(zhì)僅將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為15S-氫過(guò)氧二十碳四烯酸[46-47]。PTGS2 是前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2，又稱環(huán)加氧酶2，是花生四烯酸（AA）轉(zhuǎn)化為前列腺素（PGs）的關(guān)鍵酶。在前列腺素合成初期起催化作用，可將AA 代謝成各種PGs 類產(chǎn)物[48]，這些PGs 參與維持機(jī)體內(nèi)多種生理過(guò)程，是胚胎移植初期時(shí)胚胎和子宮信息交流的重要介質(zhì)之一，在調(diào)節(jié)發(fā)情周期、妊娠維持和分娩中起著關(guān)鍵作用[49-50]。PTGIS 是前列環(huán)素合酶，是細(xì)胞色素P450（CYP450）超家族的8 族（CYP8）成員，也是AA 的主要產(chǎn)物[51]。研究發(fā)現(xiàn)，PTGIS 在許多生理和病理過(guò)程中起著重要作用，該基因編碼前列腺素12 合酶，并催化前列腺素I2（PGI2）的合成[52]。atp1a2是ATP 酶A2 亞單位，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于P 型陽(yáng)離子，轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶家族和Na+/K+-ATP 酶亞家族[53]。

這5 個(gè)差異基因中有3 個(gè)基因均與AA 有一定的相關(guān)性，即ALOX15B 是AA15 脂氧合酶，PTGS2 是AA 轉(zhuǎn)化為PGs 的關(guān)鍵酶，PTGIS 是AA 的主要產(chǎn)物。AA 是一種不飽和脂肪酸，由磷脂酶 A2（Phospholipase A2，PLA2）催化而來(lái)，可通過(guò)環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX）、脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）與CYP450 途徑生成多種代謝產(chǎn)物。在海水魚(yú)類中，AA 主要在生長(zhǎng)、存活、調(diào)節(jié)免疫、抗應(yīng)激及繁育等方面發(fā)揮重要作用[54-56]。目前，關(guān)于AA 在魚(yú)類方面的研究主要集中在飼料中改變AA 含量，分析其對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)性能、脂質(zhì)代謝、脂肪酸營(yíng)養(yǎng)、腸道組織、色素沉積等方面的影響。Sargent 等[55]指出，在比目魚(yú)的開(kāi)口餌料中添加一定量的AA，將對(duì)背部皮膚色素沉積產(chǎn)生較大影響。Estévez 等[57]認(rèn)為，飲食中增加的AA 含量對(duì)色素沉積有負(fù)面影響。McEvoy 等[58]、Copeman 等[59]、Bell 等[60]的研究均表明，高AA 水平與各種比目魚(yú)的色素沉著有關(guān)[58-60]。Willey 等[61]用富含AA 的輪蟲(chóng)(Rotifer)和鹵蟲(chóng)（Artemia）喂養(yǎng)大西洋牙鲆（Paralichthys dentatus），發(fā)現(xiàn)增加AA 飼料和色素沉著發(fā)生率存在劑量依賴效應(yīng)。Villalta 等[62]改變了塞內(nèi)加爾舌鰨（Cynoglossus senegalensis）日糧中AA 的含量，發(fā)現(xiàn)隨著AA 的增多伴隨著PG 含量的升高，并且PG 含量與色素沉積存在著緊密的相關(guān)性。Lund 等[63]在歐洲鰨（Solea solea）中發(fā)現(xiàn)，體色異常只與AA 的絕對(duì)量相關(guān)，而與AA 和其他多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）的比例無(wú)關(guān)。Boglino 等[64]研究發(fā)現(xiàn)，PGE2 在塞內(nèi)加爾舌鰨中也引起了體色異常的結(jié)果。以上研究都表明AA 的變化會(huì)影響比目魚(yú)類體表色素沉著。導(dǎo)致AA 誘導(dǎo)比目魚(yú)色素沉著的確切機(jī)制尚不清楚，但已存在3 種假說(shuō)：第一，改變飼料中AA 含量可能導(dǎo)致神經(jīng)組織膜的次優(yōu)生化組成，而神經(jīng)組織參與控制變態(tài)、黑色素合成和色素團(tuán)分化[57]；第二，AA 衍生的二十碳五烯酸的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類經(jīng)歷非生物化學(xué)誘導(dǎo)的應(yīng)激，從而導(dǎo)致色素失調(diào)[55]；第三，酪氨酸酶的合成和降解是調(diào)節(jié)色素沉著所必需的，飲食中n-6多不飽和脂肪酸可以改變酪氨酸酶的合成和降解[65]。有研究將正常體色個(gè)體與由AA 修飾引起的變色日本牙鲆進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)黑素皮質(zhì)激素（a-黑素細(xì)胞刺激激素a-MSH 和腎上腺皮質(zhì)激素ACTH）在色素形成過(guò)程中起重要作用[66]。而MSH 的作用主要為激活酪氨酸酶，并促進(jìn)酪氨酸酶合成，從而促進(jìn)黑色素合成，使皮膚顏色加深。

本研究篩選出半滑舌鰨體色異常相關(guān)的5 個(gè)差異基因，其中alox15b、ptgs2可以將AA 轉(zhuǎn)變或者使其代謝為其他物質(zhì)，從而改變半滑舌鰨中AA 的含量。而ptgis不僅是AA 的主要產(chǎn)物，還是CYP450 中的成員，飼料中營(yíng)養(yǎng)素對(duì)魚(yú)類體色的影響主要就是通過(guò)魚(yú)體色素細(xì)胞或色素體起作用的。因此，本文推測(cè)alox15b、ptgs2、ptgis基因是通過(guò)影響AA 進(jìn)而影響了半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)體色的色素沉積。本研究為半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)體色異常的進(jìn)一步研究提供了分子線索，關(guān)于AA影響魚(yú)類體色異常的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。