董海麗

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

病毒依靠宿主細胞完成其復(fù)制周期，它們利用宿主細胞膜表面受體及胞內(nèi)輔助因子進入細胞并且利用宿主細胞代謝進行其基因組的復(fù)制，組裝子代病毒體并傳播。為了治療和預(yù)防病毒感染，研究人員進行了基因篩查，而CRISPR-Cas系統(tǒng)正成為基因篩查中必不可少的工具。CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用廣泛，是一種分子診斷工具，可用于功能性缺失的基因篩查。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組修飾可激活或抑制基因表達，并且有標記特定基因組位點的功能區(qū)域，從而準確編輯基因組[2]。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異性與可重復(fù)性使其成為一種認可度較高的基因編輯工具。近幾年，CRISPR-Cas9全基因組編輯后的篩選系統(tǒng)已應(yīng)用于病毒受體及其所需的宿主胞內(nèi)輔助因子的鑒定，包括臨床相關(guān)病毒受體，例如丙型肝炎病毒（HCV）受體、登革熱病毒（DENV）受體[3]、寨卡病毒（ZIKV）受體、西尼羅河病毒（WNV）受體等[4]；也包括病毒入侵宿主細胞所需的胞內(nèi)輔助因子，例如甲型流感病毒（IAV）入侵的輔助因子capicua（CIC）和人類免疫缺陷病毒（HIV）入侵的輔助因子酪氨酰蛋白質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶2（TPST2）與溶質(zhì)載體家族成員B2（SLC35B2）等[5]。

本文介紹了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，該系統(tǒng)能進行全基因組規(guī)模的敲除，篩選受體及胞內(nèi)輔助因子，并且將CRISPR-Cas9系統(tǒng)篩選與單倍體細胞篩選（Haploid），酵母雙雜交系統(tǒng)篩選，RNA干擾（RNAi）等其他遺傳篩選技術(shù)進行比較，以增進我們對篩選技術(shù)的認識和優(yōu)化相應(yīng)的篩選方案。

1 CRISPR-Cas9 全基因組敲除系統(tǒng)

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是細菌和古細菌中進化出的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，包括tracrRNA，crRNA 和Cas9蛋白。在三者共同介導(dǎo)下，發(fā)揮CRISPR-Cas9的靶向切割作用，該過程由三個不同階段組成：識別、表達和切割，如圖1。

圖1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)抵御外源核酸入侵宿主細胞

在識別階段，外來核酸作為新的CRISPR間隔區(qū)定向整合到由重復(fù)序列分隔的CRISPR陣列中，從而產(chǎn)生入侵元件的遺傳記憶。在表達階段，CRISPR陣列轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，隨后加工成包含間隔區(qū)序列與重復(fù)序列連接的成熟crRNA。在干擾階段，crRNA通過互補的重復(fù)序列與tracrRNA結(jié)合形成復(fù)合物稱為向?qū)NA（sgRNA），它引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向切割外源入侵的DNA序列[6]。因此，CRISPR-Cas9系統(tǒng)被開發(fā)成一種基因編輯技術(shù)。

2013 年，張鋒等設(shè)計了兩種II 型CRISPR-Cas系統(tǒng)，證明了Cas9核酸酶在sg RNA引導(dǎo)下，CRISPRCas9系統(tǒng)可精確編輯哺乳動物細胞基因組，并設(shè)計多個sgRNA序列應(yīng)用于同時編輯基因組中的多個位點，繼而發(fā)展為CRISPR-Cas9全基因組敲除系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于病毒篩選宿主細胞的互作基因[7]。

2 CRISPR-Cas9 全基因組敲除系統(tǒng)在病毒宿主作用因子鑒定中的應(yīng)用

病毒通過一定的途徑入侵宿主細胞，它利用宿主細胞提供的蛋白質(zhì)與核酸“原料”進行自我復(fù)制，由于病毒與宿主細胞作用因子產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致機體出現(xiàn)一系列臨床癥狀。這些“作用因子”可通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的全基因敲除系統(tǒng)鑒定出來。該系統(tǒng)是以設(shè)計不同的sgRNA作為一個包含兩萬個基因被敲除的質(zhì)粒庫，以慢病毒為載體進行基因組穩(wěn)轉(zhuǎn)后達到敲除效果的一個體系。在這個體系中，期望值是達到每個細胞中僅有一個基因的功能被破壞，再使用病毒侵染該體系作用下的細胞，獲得抗病毒細胞。在這整個篩選過程中必須達到以下幾個條件：必須因病毒在細胞內(nèi)的擴增導(dǎo)致細胞死亡；由于每個過程都有可能導(dǎo)致sgRNA的丟失，因此要嚴格控制細胞數(shù)量以及sgRNA的使用量[8]。近幾年，CRISPR-Cas9全基因組篩選應(yīng)用于以下病毒作用相關(guān)基因的篩選：2016年，Kei Haga等使用CRISPRCas9系統(tǒng)篩選到CD300lf 與 CD300ld，它們是感染小鼠的諾如病毒（MNV）受體[9]；2018年，Michael S.Diamond等基于CRISPR-Cas9的全基因組篩選，確定了細胞粘附分子Mxra8是部分致關(guān)節(jié)炎的甲型病毒入侵受體[10]等。這些研究成果表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因篩查應(yīng)用中已成為一種有力工具，它的廣泛應(yīng)用促進了我們對病毒致病機制的理解。

3 其他篩選技術(shù)在病毒宿主作用因子鑒定中的應(yīng)用

單倍體細胞篩選是對培養(yǎng)的單倍體細胞系中的基因進行插入突變，使含有剪接受體位點的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因陷阱可以整合到宿主基因組中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后的截短mRNA，從而破壞對應(yīng)蛋白質(zhì)的表達。目標蛋白表達的受阻對病毒復(fù)制產(chǎn)生顯著影響，以此來識別病毒感染關(guān)鍵的宿主因子。人們利用單倍體遺傳篩選已發(fā)現(xiàn)了埃博拉病毒和拉薩病毒是利用溶酶體蛋白作為受體[11,12]。

酵母雙雜交篩選是通過真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程所建立的體系。真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。只有這兩個結(jié)構(gòu)域在空間上充分接近時，才能發(fā)揮完整的轉(zhuǎn)錄活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。因此，酵母雙雜交篩選是基于這兩個結(jié)構(gòu)域分別與待研究相互作用的兩個蛋白構(gòu)建融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到酵母中表達蛋白，若二者有相互作用，下游的報告基因得以轉(zhuǎn)錄，根據(jù)報告基因的表達情況，從而判斷兩個蛋白是否有相互作用[13]。研究人員利用酵母雙雜交篩選到真核翻譯起始因子（EIF4A2）與豬的胃腸炎冠狀病毒（TGEV）的復(fù)制相關(guān)[14]；確定了層粘連蛋白受體（LAMR）與草魚呼腸孤病毒（GCRV）外衣殼蛋白VP5有相互作用[13]。

RNA 干擾（RNAi）是由雙鏈RNA（DsRNA）加工成短干擾RNA（SiRNAs）SiRNAs與靶mRNAs結(jié)合后切割引起的一種基因沉默形式[15]。2015年Asiel A.Benitez等應(yīng)用RNAi確定抗黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）與甲型流感病毒（IAV）入侵相關(guān)[16]；Haoyang Li等運用RNAi篩選顯示Toll4在對抗蝦白斑綜合征病毒（WSSV）感染中具有重要作用[17]。

4 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)與其他篩選方法的比較

與其他篩選技術(shù)相比之下，CRISPR-Cas9全基因組篩選的優(yōu)勢體現(xiàn)在：可鑒定促進病毒復(fù)制的宿主作用因子和抗病毒宿主作用因子。在基因功能喪失的篩查中，CRISPR-Cas9敲除細胞系中的病毒受體基因，這使細胞系對病毒感染產(chǎn)生抵抗力；而在基因功能增強的篩查中，病毒受體在細胞系中過表達，這使病毒增強對細胞的感染[8]。CRISPR-Cas9與單倍體細胞篩選相比，單倍體細胞篩選也可用于全基因組基因功能缺失篩選，但二者最大的區(qū)別在于單倍體細胞篩選不適于用作基因功能增強的篩查，并且單倍體細胞篩選使用的細胞類型也受限；與RNA干擾篩選相比CRISPR-Cas9篩查通常有較少的假陽性，由于短干擾RNA長度受限，較容易干擾非靶基因表達，易脫靶；與酵母雙雜交篩選相比，酵母雙雜交篩選不能用于全基因組基因功能喪失的篩查與基因功能增強的篩查，并且僅限用于真核酵母中[11,13,18]。

如上所述，CRISPR-Cas9 與其他篩選技術(shù)相比之下盡顯其優(yōu)勢（表1），盡管CRISPR-Cas9脫靶效率很低，但研究人員依舊在不斷完善這個技術(shù)難題。

表1 各種篩選方案的比較

機制篩選后細胞表型基因功能影響設(shè)計脫靶效應(yīng)適用的細胞類型CRISPR-Cas9敲除篩選產(chǎn)生出錯的NHEJ，導(dǎo)致移碼突變完全敲除基因，導(dǎo)致增強病毒感染增強每個基因設(shè)計3-6 條sgRNA SgRNA的不配對導(dǎo)致基因組中的脫靶切割大多數(shù)常見細胞單倍體篩選整合含有剪接受體位點基因?qū)е陆囟痰膍RNA完全敲除基因，導(dǎo)致增強病毒感染增強每個基因設(shè)計525個獨立基因缺失無單倍體細胞或近單倍體細胞RNA干擾篩選短干擾RNA靶mRNAs結(jié)合，導(dǎo)致其切割和降解基因表達的部分下調(diào)，病毒感染增強效果不明顯每個基因4-6個短干擾RNA短干擾RNA的不配對導(dǎo)致脫靶mRNA大多數(shù)常見細胞酵母雙雜交篩選基因的過表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)互作靶基因表達上調(diào)，導(dǎo)致增強病毒感染增強基因的過表達無真核酵母細胞

5 總結(jié)與展望

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)作為基因工程方面的工具，開始改變生物醫(yī)學(xué)研究，包括傳染病、癌癥和基因治療。這種新的方法也被用來更好地理解病毒如何利用它們的宿主，并開發(fā)新的抗病毒方案。目前，在使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行全基因組篩選時，還會出現(xiàn)以下問題：基因丟失的情況以及CRISPRCas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，使這項技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的局限性。針對這些出現(xiàn)概率極低的問題，后續(xù)的研究者也在不斷完善，例如，在進行慢病毒的包裝時，可通過加大sgRNA質(zhì)粒庫的使用濃度以及在使用慢病毒進行全基因組構(gòu)建時，增加細胞數(shù)量來最大限度地防止基因丟失；而張鋒等使用Cas9核酸酶突變體和成對的引導(dǎo)RNA的雙重切割策略，可最大限度地減少脫靶切割，這也開始了CRISPR-Cas系統(tǒng)的完善[8,19]。通過對CRISPR-Cas9系統(tǒng)不斷完善，相信未來一定可以在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域大放異彩。