張春秋，李斯貝，胡紫玉，呂桂云，王建設

（1.農業(yè)農村部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室·蔬菜種質改良北京市重點實驗室·北京市農林科學院蔬菜研究中心 北京 100097； 2.河北農業(yè)大學園藝學院 河北保定 071001）

甜瓜（L.）屬于葫蘆科甜瓜屬，是一種國內外普遍栽培的水果型作物。2020 年全球甜瓜產(chǎn)量已達2.7×10t，種植面積達1.1×10hm（FAO，www.fao.org/faostat）。隨著甜瓜的規(guī)模化生產(chǎn)，病蟲害的問題也隨之日益嚴重，造成甜瓜產(chǎn)量銳減、品質下降。近年來，基因工程技術快速發(fā)展，使得運用轉基因技術手段進行種質定向改良成為培育抗病優(yōu)質甜瓜新品種的有效途徑。建立一個穩(wěn)定、高效的再生體系，是基因工程育種成功的前提條件。

影響甜瓜再生能力的主要因素有基因型、外植體類型及其生長狀態(tài)、激素種類和濃度配比。基因型對甜瓜再生能力起決定性的作用，不同類型甜瓜的再生潛力有明顯差異，已有研究分別針對厚皮和薄皮等不同類型甜瓜建立了特定的再生體系。但甜瓜離體再生過程中仍存在愈傷組織分化出芽困難、不定芽誘導率較低和再生體系重復性差等問題。因此，對不同類型甜瓜再生體系進行系統(tǒng)優(yōu)化以建立廣泛適用的再生體系顯得尤為迫切。外植體的類型及生長狀態(tài)是建立甜瓜再生體系的影響因素之一。目前，已有選用子葉、下胚軸、真葉、葉片等通過器官發(fā)生途徑再生出完整植株的報道。其中，子葉相比其他器官出愈較快且愈傷組織緊密，不定芽誘導率也相對較高，被認為是甜瓜再生的首選外植體。甜瓜子葉的再生能力與苗齡密切相關，不同苗齡甜瓜子葉的不定芽誘導率存在較大差異，合適的苗齡是成功誘導不定芽的關鍵因素。影響甜瓜再生的另一個重要因素是生長調節(jié)劑的種類和濃度配比。目前，常用于甜瓜再生的激素有6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等，選擇合適的激素種類和濃度配比是建立高效穩(wěn)定的甜瓜再生體系的研究重點。

筆者在本試驗中以不同類型（厚皮、厚薄皮中間型和薄皮）的8 個甜瓜自交系材料子葉作為外植體，對基因型、外植體苗齡、不同激素組合和濃度配比等影響甜瓜再生效率的主要因素進行系統(tǒng)深入研究，以構建適于不同類型甜瓜的高效再生體系，為甜瓜快速繁殖、應用遺傳轉化技術對甜瓜種質資源進行定向改良等提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者分別以厚皮類型甜瓜M1（sspvar）和M2（sspvar）；厚薄皮類型甜瓜M32 和M36（ssp.var.）；薄皮類型甜瓜M250（ssp.var.）和M265（sspvarMakino）；對照組薄皮甜瓜BU-21/3（sspvar）和厚皮甜瓜Védrantais（sspvar）等不同類型8 個甜瓜自交系作為供試材料。其中，M1、M2、M32、M36、M250 和M265 為北京市農市農林科學院蔬菜中心選育，BU-21/3 和Védrantais種子分別由以色列農業(yè)科學院Yaakov Tadmor 研究員和美國農業(yè)部J.D.McCreight 研究員饋贈，在北京市農林科學院蔬菜研究中心溫室擴繁。其中，Bu-21/3 為具有高再生能力的甜瓜材料，Védrantais為研究甜瓜再生體系常用的材料。試驗于2016 年3 月至2019 年10 月在北京市農林科學院蔬菜研究中心進行。以MS 為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同生長階段配制添加不同激素濃度配比。其中，激素種類包括IAA、IBA 和6-BA。以上試劑均購于美國Sigma試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 挑取飽滿的甜瓜種子，剝去種皮后用70%（，后同）的乙醇浸泡20～30 s，無菌水洗2～3 次，用1%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水洗滌4～5 次后，用無菌濾紙吸干多余水分，置于MS培養(yǎng)基（蔗糖質量濃度30 g·L，瓊脂質量濃度7 g·L，pH 5.8）中暗培養(yǎng)。

1.2.2 不定芽的誘導 取苗齡為3 d 的甜瓜子葉，切除胚根和子葉兩端1～2 mm 后，剝除子葉的內種皮，將子葉部分橫切為二作為外植體，葉背面向下接種于附加不同激素配比的誘導培養(yǎng)基（見表1），置于25 ℃，光照度為2000 lx，光周期為16 h/8 h 培養(yǎng)。30 d 后調查統(tǒng)計發(fā)生不定芽的外植體數(shù)，以篩選出不定芽誘導最佳激素配比組合，并比較基因型不定芽誘導率的差異。分別取2、3、4、5 d 苗齡的甜瓜子葉，置于MS+1.0 mg·L6-BA 不定芽誘導培養(yǎng)基中，30 d 后觀察不同苗齡外植體不定芽的誘導情況。每個處理30 個外植體，3 次重復。不定芽誘導率/%=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。采用SPSS 17.0 軟件中的Duncan’s multiple range test 方法進行差異顯著性分析。

表1 不同濃度激素配比對不同類型甜瓜材料不定芽誘導率的影響 %

1.2.3 不定芽的伸長與生根 選取厚皮類型M2、厚薄皮類型M32 和薄皮類型M265 三個甜瓜品種進行不定芽伸長和生根試驗。不定芽誘導培養(yǎng)3～4周，待叢生芽長至0.5～1.0 cm，及時切下分化的不定芽轉入芽伸長培養(yǎng)基（表2），比較不同激素配比對不定芽伸長的影響。當不定芽伸長到2～3 cm 時，切下不定芽，轉入生根培養(yǎng)（表3），比較不同激素對不定芽生根的影響。待確定最佳濃度配比后，將生根培養(yǎng)基添加3.0 mg·L的活性炭防止形成玻璃苗。生根率/%=生根的不定芽數(shù)/接種的總不定芽數(shù)×100。1.2.4 試管苗的移栽 待試管苗根系發(fā)達后，煉苗3～5 d 后，洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽入預先經(jīng)高壓滅菌的蛭石和草炭土1∶1（∶）基質中于溫室中培養(yǎng)，前期注意保濕遮陰，3～5 d 后逐漸增加透光量。

表3 不同激素濃度對生根率的影響

2 結果與分析

2.1 不同類型甜瓜材料和激素配比對甜瓜不定芽誘導的影響

由表1 可以看出，不同類型甜瓜在含相同激素濃度配比的培養(yǎng)基中不定芽誘導率表現(xiàn)有所不同，薄皮型甜瓜M250 和M265 不定芽誘導率高于厚皮和厚薄皮類型。此外，不定芽的誘導和分化與6-BA 和IAA 的質量濃度配比密切相關。隨著6-BA 和IAA 質量濃度的增加，不定芽的誘導率隨之降低，8 個不同甜瓜材料在MS8（MS+2.0 mg·L6-BA+0.6 mg·LIAA）不定芽誘導率最低。分析發(fā)現(xiàn)在含1.0 mg·L6-BA 的培養(yǎng)基中添加低質量濃度的IAA（0.2 mg·L）對不定芽的誘導影響較小，8 個不同類型甜瓜材料在MS1（MS+1.0 mg·L6-BA）和MS2（MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LIAA）上的不定芽誘導率均沒有顯著性差異。不同基因型甜瓜材料的不定芽誘導最佳培養(yǎng)基有所不同，對照組（BU-21/3 和Védrantais），厚皮型（M1 和M2），厚薄皮類型（M32 和M36）和薄皮型M265 在MS1 培養(yǎng)基中不定芽誘導率最高，分別為90.3%、87.3%、72.0%、83.0%、73.6%、75.6%和89.3%。其中，對照組BU-21/3 不定芽誘導率最高，薄皮型M265 表現(xiàn)出與對照組相近的較強再生能力。薄皮型甜瓜M250 在MS2 培養(yǎng)基上誘導率最高（85.3%），但其在MS1 培養(yǎng)基上同樣具有較高的誘導率（84.7%）。綜合考慮，不同甜瓜材料后續(xù)試驗采用的不定芽誘導培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg·L6-BA。

2.2 不同苗齡子葉外植體對不定芽誘導的影響

由圖1 可知，不同基因型甜瓜在2 d 苗齡時子葉塊不定芽誘導率最低，3～4 d 苗齡的子葉塊不定芽的誘導率相對較高，在72%～90%之間。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型材料均在苗齡為3 d 時表現(xiàn)出的不定芽誘導率最高，苗齡增大后誘導率均有所下降。因此，最好采用3 d 苗齡的子葉作為外植體進行甜瓜再生培養(yǎng)。

圖1 苗齡對子葉塊不定芽誘導率的影響

2.3 不定芽伸長和生根條件優(yōu)化

M2、M32 和M265 三個不同類型材料在不同激素濃度配比的培養(yǎng)基上不定芽生長狀態(tài)較為一致，在高濃度6-BA 的MS 培養(yǎng)基上生長較快，但容易形成玻璃化苗，6-BA 的質量濃度為0.1 mg·L時能滿足不定芽的伸長生長需求，且不定芽葉色深綠，節(jié)間適中，莖較粗。添加微量的IAA 有助于莖的正常生長，當IAA 濃度較高時，不定芽生長較快，節(jié)間變長且莖較細，在一定程度上還會加重幼苗的玻璃化現(xiàn)象。因此，MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 是適于不定芽伸長的最佳培養(yǎng)基，在此條件下生長的試管苗葉色深綠、節(jié)間適中、生長健壯，2 周左右生長成2～3 cm 高的健壯苗（表2，圖2）。

表2 不同激素濃度對甜瓜不定芽伸長的影響

圖2 M1 甜瓜組培苗再生過程

待不定芽伸長至2～4 cm 時，將其移入生根培養(yǎng)基中誘導生根。結果表明，相較于高濃度IBA 培養(yǎng)基，添加低質量濃度0.1 mg·LIBA 誘導生根率較高，M2、M32 和M265 的生根率分別高達86.7%、91.1%和89.2%，并且根系形態(tài)正常、較為粗壯、須根較多。隨著IBA 濃度的升高，生根率逐漸降低，3種類型甜瓜材料在含0.5 mg·LIBA 的培養(yǎng)基上生根率與0.1 mg·LIBA 相比顯著降低，根系明顯變細且根量減少。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的IAA時，厚皮型M2 和厚薄皮M32 的生根率無顯著性差異；薄皮類型M265 在0.1、0.3 mg·LIAA 的培養(yǎng)基上生根率差異顯著，但均低于添加同樣濃度的IBA。所有類型甜瓜材料在IAA 培養(yǎng)基上生根速度快，但根系較細，根量較少，不利于試管苗移栽成活。在不定芽生根的過程中也存在玻璃化現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)在生根培養(yǎng)基中添加3 g·L的活性炭能使培養(yǎng)中玻璃化苗比例下降且根系生長健壯（圖2）。甜瓜再生植株最佳的生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·LIBA+3 g·L活性炭。

3 討論與結論

合適的激素種類和濃度配比是影響甜瓜再生效率的關鍵因素，首先表現(xiàn)在對不定芽的誘導上。6-BA 是誘導出不定芽的必需激素。IAA 對不定芽誘導影響較小，但合適配比的6-BA 與IAA 共同使用可以提高不定芽誘導率。以往的甜瓜再生體系研究中，其激素種類和濃度配比因甜瓜品種差異而有所不同。筆者在本試驗中以具有高再生能力的甜瓜材料BU-21/3（var）和研究甜瓜再生體系常用的Védrantais（var）為對照，對比了甜瓜自交材料在含有不同激素濃度配比培養(yǎng)基上的再生效率，以篩選適用于不同類型甜瓜再生體系。發(fā)現(xiàn)適當質量濃度的6-BA（1.0 mg·L）對甜瓜不定芽的誘導有促進作用；6-BA 質量濃度過高（2.0 mg·L）不但不利于誘導不定芽，而且會再生出很多畸形芽，玻璃化嚴重，難以發(fā)育成正常植株。本試驗中所用的不同類型8個甜瓜材料中，除M250 外，其他材料在MS+6-BA 1.0 mg·L上的不定芽誘導率最高，M250 在添加0.2 mg·LIAA 的培養(yǎng)基上不定芽誘導率最高，其他類型甜瓜在添加IAA 后反而會使誘導率降低，這可能是由于外植體內含有內源生長素，內源生長素含量高的品種在組培過程中添加IAA，會抑制不定芽的誘導。在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型材料誘導率存在差異，薄皮甜瓜的再生能力高于厚皮類型和厚薄皮類型。

影響甜瓜不定芽誘導率的另一重要因素是外植體苗齡，本試驗中所用的不同基因型甜瓜子葉均在3 d 苗齡時表現(xiàn)出最高的誘導效率。在以往的研究中，針對不同品種甜瓜最佳苗齡范圍從2～6 d 不等，苗齡增大后，不定芽誘導率迅速下降，超過10 d苗齡的甜瓜子葉幾乎不能誘導出不定芽。這可能與甜瓜子葉的內源激素有關，苗齡小的子葉內源激素水平較高，細胞全能性較好，與外源激素協(xié)同作用有利于不定芽高效誘導。

在植物組織培養(yǎng)生根過程中常用的激素有萘乙酸（NAA）、IBA 和IAA，不同激素對甜瓜不定芽的生根影響不同。有研究表明NAA 無論濃度高低都對甜瓜品種生根誘導存在抑制作用。故而本試驗中并未設置NAA 濃度條件。低濃度的IBA 和IAA，對甜瓜的生根誘導有一定的促進作用。當IAA 濃度較高時容易誘導愈傷組織的形成，使根的形成受到抑制。筆者的研究顯示，M2、M32 和M265 的不定芽在添加0.1 mg·LIBA的MS 培養(yǎng)基上生根率最高，且根系生長狀態(tài)良好。添加IAA 的培養(yǎng)基生根率低，主根少且細，不利于后續(xù)再生苗移栽成活，添加IBA 生根狀態(tài)明顯好于添加IAA 的培養(yǎng)基。

筆者在本試驗中通過對不同類型甜瓜再生體系進行系統(tǒng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)3 d 苗齡的甜瓜子葉最適合進行不定芽的誘導，并且在含有1.0 mg·L6-BA 的MS 培養(yǎng)基上不定芽誘導率較高。不定芽在MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 培養(yǎng)基上伸長狀態(tài)最好，在含有0.1 mg·LIBA 和3 g·L活性炭的培養(yǎng)基上生根最優(yōu)。筆者在本試驗中建立的適合不同基因型甜瓜的高效再生體系，為后續(xù)通過遺傳轉化進行甜瓜種質定向改良奠定了基礎。