張 瑩， 婁方明， 楊建文， 余 蘭*

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 遵義 563000； 2. 湖北民族大學(xué)武陵山天然藥物研究所， 恩施 445000)

圓葉薄荷 (Mentharotundifolia(L.) Huds.)為唇形科薄荷屬植物，又名魚香草、血香菜、山茴香、土薄荷等[1]。圓葉薄荷全草可入藥，味辛甘，性微溫，辛涼解表[2]，常用于治療感冒發(fā)熱、頭痛、咽痛、咳嗽、胃腸脹氣等[3]。圓葉薄荷的藥理學(xué)研究表明，其可緩解神經(jīng)緊張，抗痙攣，抑制胃腸平滑肌收縮[4]；促進(jìn)呼吸道腺體分泌，抗菌和抗炎[5]；鎮(zhèn)痛、清除自由基、抗氧化[6-8]。在貴州，圓葉薄荷也常被用于烹調(diào)佐料，其香味獨(dú)特，增強(qiáng)食欲，俗稱魚香草。無論藥用還是食用，決定其藥效和風(fēng)味價(jià)值的主要因素均為其揮發(fā)油的成分組成及含量[9]。

不同氣候、不同產(chǎn)地薄荷屬植物其揮發(fā)油成分存在明顯差異[10-11]。貴州(黔)產(chǎn)圓葉薄荷(魚香草)是當(dāng)?shù)胤浅Ｖ乃幉氖巢?，具有很高的?jīng)濟(jì)價(jià)值，但是其揮發(fā)油成分研究未見報(bào)道，未能體現(xiàn)出黔產(chǎn)圓葉薄荷的差異性和特殊性，這非常不利于黔產(chǎn)圓葉薄荷的進(jìn)一步開發(fā)利用。因此，有必要開展對(duì)黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油的成分研究。目前從薄荷屬植物中提取揮發(fā)油的方法包括水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、同時(shí)蒸餾萃取法等傳統(tǒng)方法，雖然操作簡(jiǎn)單、設(shè)備便宜，但藥材、溶劑用量多，耗時(shí)，環(huán)境不友好；也有超臨界CO2萃取技術(shù)[12]、頂空固相微萃取法[13]等現(xiàn)代方法，其優(yōu)點(diǎn)在于萃取時(shí)間短、環(huán)保、揮發(fā)油品質(zhì)好、雜質(zhì)少等。尤以頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)在揮發(fā)油分析方面獨(dú)樹一幟，因?yàn)镠S-SPME無需提取劑，藥材用量極少，可直接與其他設(shè)備聯(lián)用，集提取、分離、鑒定為一體，分析迅速且數(shù)據(jù)精確。因此本文采用HS-SPME萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS分析鑒定技術(shù)對(duì)黔產(chǎn)圓葉薄荷中揮發(fā)油進(jìn)行了組分分析，以全面獲得黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油組成信息，并建立起一套快速、準(zhǔn)確的圓葉薄荷揮發(fā)油分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

黔產(chǎn)圓葉薄荷購自貴州遵義市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)地貴州省遵義市，該藥材由遵義醫(yī)科大學(xué)楊建文副主任藥師鑒定為Mentharotundifolia(L.) Huds.，中文名為圓葉薄荷。

1.2 主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890-5973N)、手動(dòng)固相微萃取儀(SPME-GC，內(nèi)含3種型號(hào)萃取纖維頭：100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA)，使用前需將萃取頭按說明書要求進(jìn)行老化)、氣相色譜頂空加熱器(HP-1510)。

1.3 揮發(fā)油的HS-SPME萃取

1.3.1 萃取流程 將圓葉薄荷風(fēng)干后粉碎成粉末，稱取適量置于容積為5 mL的樣品瓶中，保持樣品瓶上部有一定高度的中空，蓋上含有膠墊的瓶蓋并擰緊。將樣品瓶置于頂空加熱器中，在合適溫度下平衡30 min，以釋放揮發(fā)油。然后將接上手柄的纖維頭插入到樣品瓶中并停留在上部空間，利用手柄推出裸露的萃取頭進(jìn)行頂空萃取。一段時(shí)間后取出萃取頭并快速插入到氣相色譜儀的進(jìn)樣口中進(jìn)行解吸附。

1.3.2 萃取條件的優(yōu)化 在萃取過程中，對(duì)不同極性的萃取頭、樣品用量、萃取溫度、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間等重要影響參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳萃取效果。

1.4 揮發(fā)油的GC-MS分析

1.4.1 色譜條件設(shè)定 色譜柱Agilent HP-5MS；樣品汽化室溫度260 ℃；進(jìn)樣方式采用不分流；分離溫度采用程序升溫，以3 ℃/min的升溫速率從50 ℃升溫至230 ℃，最終溫度保持5 min；流動(dòng)載氣為高純氦氣，流速1 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件設(shè)定 采用EI電離方式，電子能量為70 eV；離子源與四極桿溫度分別設(shè)定為230、150 ℃；溶劑延遲時(shí)間4.2 min；m/z掃描范圍30～500。

1.4.3 積分條件設(shè)定 各組分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用峰面積歸一化法計(jì)算，為保證結(jié)果的可靠性排除噪音干擾，設(shè)定可積分的峰面積最小值為13.5，最窄峰寬為0.067；質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索數(shù)據(jù)庫采用Wiley7Nist05、NIST05這2種質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索比對(duì)，并給出匹配數(shù)據(jù)和化合物名稱，同時(shí)結(jié)合人工解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 萃取頭選擇 不同極性的萃取頭對(duì)不同成分組成的揮發(fā)油萃取效果差異較大，這取決于材質(zhì)本身分子結(jié)構(gòu)以及空隙與揮發(fā)油分子之間的相互作用強(qiáng)弱。對(duì)3種不同極性的萃取頭(100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA)進(jìn)行吸附能力的考察，以檢出峰的數(shù)量和總峰面積為雙重衡量指標(biāo)。當(dāng)樣品用量(質(zhì)量)為0.2 g，平衡吸附溫度60 ℃，吸附時(shí)間為10 min時(shí)，100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA這3種萃取頭分別檢出83、46、45個(gè)峰；總峰面積分別為3.116×108、5.315×107、2.528×108。結(jié)果表明100 μm PDMS萃取頭更能有效地與圓葉薄荷揮發(fā)油相互作用，達(dá)到理想的吸附效果，因此選用100 μm PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取條件 樣品用量、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)色譜總峰面積的影響結(jié)果如圖1所示，通過考察這3種影響因素獲得最佳萃取條件。

(1)樣品用量。萃取頭體積小，容量低，因此樣品用量并非越多越好，但是太少則會(huì)萃取不足，導(dǎo)致信號(hào)低，成分檢出不完整。以色譜峰總面積為指標(biāo)，分別對(duì)0.1～0.5 g共計(jì)5份樣品進(jìn)行了考察。結(jié)果表明：當(dāng)萃取頭為100 μm PDMS，平衡及吸附溫度為60 ℃，吸附時(shí)間為10 min時(shí)，不同樣品用量(由低至高)產(chǎn)生的總峰面積分別為3.020×108、3.022×108、3.188×108、3.381×108、3.382×108，其變化趨勢(shì)如圖1A所示。樣品質(zhì)量的增加對(duì)總峰面積的增加影響較不明顯，0.4 g與0.5 g的峰面積相差無幾，因此最終確定樣品用量為0.4 g(此后數(shù)據(jù)均由0.4 g樣品獲得)。此時(shí)樣品約占瓶?jī)?nèi)容積的一半，不容易接觸萃取頭導(dǎo)致污染。

圖1 總峰面積隨樣品質(zhì)量、萃取溫度、萃取時(shí)間的變化Figure 1 The change of total peak area with the sample dosage, extraction temperature, and extraction time

(2)萃取溫度。揮發(fā)油只有超過一定溫度才能形成氣體從藥材中溢出，溫度越高溢出量越大，但存在最高閾值。同時(shí)，萃取頭也具有最佳的萃取溫度，在該溫度下吸附量最大。以色譜總峰面積為指標(biāo)，設(shè)定吸附時(shí)間10 min，選定50、60、70、80、90、100、110 ℃進(jìn)行測(cè)定，總峰面積隨萃取溫度的變化見圖1B。結(jié)果表明：當(dāng)溫度為90 ℃時(shí)，峰面積達(dá)到峰值(1.756×109)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將平衡及吸附溫度由60 ℃修正為90 ℃。

(3)萃取時(shí)間。萃取頭萃取揮發(fā)油會(huì)有一個(gè)時(shí)間過程，在一定時(shí)間內(nèi)，萃取頭會(huì)達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附平衡(吸附量=解吸量)，此時(shí)吸附量最大，體系處于飽和狀態(tài)，繼續(xù)延長(zhǎng)吸附時(shí)間已無實(shí)際意義，甚至有可能因長(zhǎng)時(shí)間加熱導(dǎo)致吸附量減少。以色譜峰總面積為指標(biāo)，設(shè)定5、10、15、20、25 min 為考察萃取時(shí)間，其總峰面積隨萃取時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖1C所示。結(jié)果表明：當(dāng)樣品用量為0.4 g，平衡吸附溫度為90 ℃時(shí)，揮發(fā)油在10 min后即達(dá)到吸附飽和，此時(shí)總峰面積為1.759×109，此后總峰面積開始下降。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為吸附時(shí)間。

2.1.3 解吸時(shí)間 解吸時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般在幾分鐘以內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間解吸意味著進(jìn)樣時(shí)間長(zhǎng)，色譜峰會(huì)變寬，分離度變差；但過短也會(huì)導(dǎo)致解吸不完全，信號(hào)低，還將影響下一次的吸附量，導(dǎo)致重現(xiàn)性差。本實(shí)驗(yàn)考察1、2、3 min的解吸分析結(jié)果后確定解吸時(shí)間為2 min，解吸溫度為色譜儀樣品汽化室溫度。在采用HS-SPME萃取黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油時(shí)，將關(guān)鍵影響因素設(shè)定為：萃取頭 100 μm PDMS；樣品質(zhì)量為0.4 g；平衡和萃取溫度90 ℃，萃取時(shí)間10 min；解吸時(shí)間2 min。在該條件下HS-SPME萃取率最佳。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

圓葉薄荷的風(fēng)味主要取決于其揮發(fā)油的組成特征，包括成分的種類及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在經(jīng)HS-SPME萃取影響因素優(yōu)化后，對(duì)黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油進(jìn)行了HS-SPME-GC-MS的萃取與分離檢測(cè)，得到如圖2所示的揮發(fā)油總離子流圖，該圖反映了圓葉薄荷揮發(fā)油中所有可能的各類物質(zhì)及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但是有些極微量成分由于儀器的局限性可能得不到鑒定。

圖2 黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油總離子流圖Figure 2 Total ion current chromatogram of essential oil from Mentha rotundifolia(L.) Huds. growing in Guizhou

在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)設(shè)定可積分的峰面積最小值為13.5，最窄峰寬為0.067時(shí)，黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油總離子流圖可積分的色譜峰為113個(gè)，其總峰面積為1.793×109，該數(shù)據(jù)表明黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油具有豐富的化學(xué)成分，這是黔產(chǎn)圓葉薄荷具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在對(duì)化合物鑒定的過程中，首先對(duì)每一個(gè)峰所測(cè)得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Wiley7Nist05、NIST05)進(jìn)行檢索比對(duì)，進(jìn)行初步的判斷，再并結(jié)合人工解析給出最終的結(jié)果。在對(duì)113個(gè)色譜峰的分析中，共有38個(gè)成分得到鑒定(表1)，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和(以峰面積計(jì))達(dá)到98.55%，該數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)高含量的成分得到確認(rèn)，而含量極低的物質(zhì)(雖然種類較多，但總峰和僅占1.45%)無法鑒定。

表1 黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油的HS-SPME-GC-MS 分析結(jié)果Table 1 The analysis of Mentha rotundifolia (L.) Huds. growing in Guizhou by HS-SPME-GC-MS

續(xù)表1

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

按優(yōu)化后的最佳方案對(duì)圓葉薄荷進(jìn)行萃取、進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，以揮發(fā)油的總峰面積為指標(biāo)考察該方法的重現(xiàn)性。6次測(cè)定的總峰面積分別為：1.793×109、1.748×109、1.810×109、1.722×109、 1.774×109、1.735×109，經(jīng)計(jì)算所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為1.95%，符合測(cè)定要求，且表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性。

2.4 不同產(chǎn)地及品種薄荷揮發(fā)油的成分比較

除黔產(chǎn)圓葉薄荷外，有報(bào)道的薄荷揮發(fā)油成分研究地區(qū)包括河南[14]、云南[15]、上海[16]、重慶[17]等地，品種也不盡相同。為了研究產(chǎn)地及品種對(duì)薄荷揮發(fā)油組成的影響，對(duì)不同產(chǎn)地和不同品種薄荷所含主要的2種揮發(fā)油相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)比。由圖3可知，無論是成分還是相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，不同產(chǎn)地及品種的薄荷所含2種主要成分差異均比較大。即使是相同品種的圓葉薄荷，重慶產(chǎn)與貴州產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油成分差異也較大。重慶產(chǎn)圓葉薄荷與貴州產(chǎn)的相比，揮發(fā)油的主要成分均為香芹酮，表明同屬種的相似性，但第二大成分不同，顯示了地域的差異性。

圖3 不同產(chǎn)地薄荷中2種主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 3 The relative mass fractions of two main components of Mentha rotundifolia (L.) Huds. from different regions

3 結(jié)論

黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油經(jīng)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)至少含有113種成分，其中有38種成分得到確證，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和占所有成分的98.55%，表明絕大多數(shù)高含量成分得到確認(rèn)。在揮發(fā)油成分組成中，以酯、醇及萜類化合物為主，其中右旋香芹酮的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.78%，是圓葉薄荷揮發(fā)油的重要成分，也是一種重要的香精香料；右旋檸檬烯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.93%，是第二大成分，檸檬烯不但具有令人愉快的檸檬樣香氣，目前在臨床上還被用于溶解膽結(jié)石和預(yù)防腫瘤[18]，同時(shí)具有很強(qiáng)的抑菌作用[19-20]。其他相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的成分有月桂烯(2.91%)、β-蒎烯(2.02%)、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己醇(2.78%)、β-波旁老鸛草烯(2.61%)、石竹烯(2.32%)、大根香葉烯D(2.28%)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用HS-SPME-GC-MS分析圓葉薄荷揮發(fā)油的方法時(shí)間短、樣品用量小、無需萃取溶劑，圓葉薄荷揮發(fā)油的主要成分得到全面展示，因此該方法可作為圓葉薄荷的揮發(fā)油成分分析的推薦方法。