王玉花，陶文靖，田秀梅，石 磊，梁?jiǎn)⒚?，韓 冀*

（1.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（青島）有限公司，山東青島 266071；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

沙門氏菌是最常見的人畜共患病病原菌，會(huì)使人和動(dòng)物出現(xiàn)胃腸炎和敗血癥等癥狀[1]。近年來，隨著我國(guó)寵物行業(yè)的快速發(fā)展，人們與寵物的關(guān)系越來越密切，寵物作為沙門氏菌宿主導(dǎo)致人類感染的風(fēng)險(xiǎn)也日益引起關(guān)注。美國(guó)疾病控制中心發(fā)現(xiàn)，在28例沙門氏菌感染病例中有13人曾在患病前8天內(nèi)接觸過嚙齒動(dòng)物[2]。寵物感染沙門氏菌的主要渠道是進(jìn)食被污染的寵物食品和水，其中寵物食品在加工過程中，容易受到原料及添加劑的污染。WONG等[3]對(duì)新西蘭市場(chǎng)銷售的寵物咬膠進(jìn)行了沙門氏菌檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新西蘭、中國(guó)、泰國(guó)和澳大利亞等各國(guó)產(chǎn)品中沙門氏菌的檢出率分別為6.7%、4.1%、3.7%和14.0%。史思等[4]調(diào)查了6家寵物食品加工企業(yè)的176份寵物食品，其中半成品沙門氏菌陽性率為7.55%，成品中陽性率為0.81%。秦超等[5]匯總分析了2012—2020年歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）中的飼料通報(bào)，RASFF共通報(bào)了188起寵物食品中檢出沙門氏菌的不合格情形，其中包括來自中國(guó)的犬貓飼料、狗咬膠和魚飼料等。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法有微生物分離純化、生化鑒定等[6]，其檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)過程復(fù)雜、無法適應(yīng)快速檢測(cè)的需求。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的迅速發(fā)展為快速準(zhǔn)確地鑒別寵物食品中的沙門氏菌提供了技術(shù)支持，但沙門氏菌類群繁多，需要篩選合適的引物及探針，同時(shí)寵物食品的成分復(fù)雜，需要尋找合適的樣品前處理方法，本研究擬建立了一種適合于寵物食品中沙門氏菌污染檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、 腸 炎 沙 門 氏 菌（Salmonella enteritidis）CMCC50335、 傷 寒 沙 門 氏 菌（Salmonella typhi）CMCC50071、 嬰 兒 沙 門 氏菌（Salmonella infantis）CICC21482、 肯 塔 基 沙門 氏 菌（Salmonella kentucky）CICC21488、 大 腸桿 菌（Escherichia coli）ATCC8739、 福 氏 志 賀 氏菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 副 溶 血 性 弧菌（Vibrio para）ATCC17802、 單 增 李 斯 特 氏 菌（Listria monocytogenes）ATCC19115、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027、 產(chǎn) 氣 腸桿菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC4352、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC11778、糞腸球菌（Enterococcus faecium）ATCC8459和粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）ATCC14041。

1.2 試劑和設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Stepone plus實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國(guó)ABI；VORTEX3渦旋振蕩器，德國(guó)IKA；5424離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；BSC-1360-LIIB2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL204-IC電子天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix，美國(guó)Thermo Fisher；緩沖蛋白胨水（BPW），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；引物及探針合成，英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，見表1。

表1 沙門氏菌PCR引物和探針

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA提取

上述實(shí)驗(yàn)菌株分別挑取一環(huán)接種至NB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用核酸蛋白儀測(cè)定其純度和濃度，提取后的模板DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：2X TaqMan Gene Expression Master Mix 為 10 μL；引物 F（10 μmol·L-1）為 1 μL； 引 物 R（10 μmol·L-1）為 1 μL； 探 針 P（10 μmol·L-1）為 1 μL；DNA 模板為 4 μL；ddH2O 補(bǔ)齊至 20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性 15 s，60 ℃退火 60 s，同時(shí) FAM通道采集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性驗(yàn)證

提取5株沙門氏菌和10株非沙門氏菌DNA后，使用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)其特異性，驗(yàn)證本研究建立的沙門氏菌PCR檢測(cè)方法的特異性，同時(shí)用無菌去離子水作空白對(duì)照。

1.3.4 寵物食品人工污染沙門氏菌的檢測(cè)

取4份全價(jià)營(yíng)養(yǎng)貓糧各25 g，向其中添加鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028稀釋菌液，添加濃度分別為 1.9 CFU/25 g、9.5 CFU/25 g、19.0 CFU/25 g和95.0 CFU/25 g，加入225 mL滅菌BPW，同時(shí)做樣品的本底測(cè)試，振蕩混勻后36 ℃培養(yǎng)過夜，通過實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)沙門氏菌。

1.3.5 傳統(tǒng)微生物法與實(shí)時(shí)熒光PCR法的比較

根據(jù)產(chǎn)品形態(tài)劃分，寵物食品主要分為濕糧和干糧兩大類別，干糧分為低溫烘焙糧、高溫膨化糧、凍干糧和風(fēng)干糧等；濕糧可分為罐頭和鮮食等。分別使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中沙門氏菌的測(cè)定》（GB/T 13091—2018）[7]與實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)表2中所列寵物食品各品類共37個(gè)樣品中的沙門氏菌進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性

采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)5株沙門氏菌和10株非沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，5株沙門氏菌均有典型S型擴(kuò)增曲線，而10株非沙門氏菌及空白對(duì)照均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，結(jié)果見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)沙門氏菌的結(jié)果

2.2 寵物食品人工污染沙門氏菌的檢測(cè)

對(duì)4份全價(jià)營(yíng)養(yǎng)貓糧進(jìn)行人工污染實(shí)試驗(yàn)后，通過實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)其中的沙門氏菌，結(jié)果表明，全價(jià)營(yíng)養(yǎng)貓糧本底未檢出沙門氏菌，而各濃度污染樣品擴(kuò)增后均可見典型S型擴(kuò)增曲線，表明該方法檢測(cè)沙門氏菌的靈敏度可達(dá)到1.9 CFU/25 g，結(jié)果見圖1。

圖1 人工污染沙門氏菌樣品檢測(cè)

2.3 傳統(tǒng)微生物法與實(shí)時(shí)熒光PCR法的比較

選擇寵物食品各品類共37個(gè)樣品，模擬污染鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028后，采用《飼料中沙門氏菌的測(cè)定》（GB/T 13091—2018）傳統(tǒng)微生物學(xué)法進(jìn)行沙門氏菌的檢測(cè)，同時(shí)取BPW增菌液提取DNA后進(jìn)行沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。37份模擬污染寵物食品樣品均檢出沙門菌，詳見表3，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)微生物法一致。

表3 兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來，由寵物引發(fā)人類感染沙門氏菌的事件逐漸增多，已成為值得關(guān)注的健康問題，應(yīng)高度重視和預(yù)防寵物在感染事件發(fā)生及擴(kuò)散中的負(fù)面作用。而寵物的沙門氏菌感染與所進(jìn)食的寵物食品中的沙門氏菌污染有直接的關(guān)系[8]，沙門氏菌能通過被污染的食品、飼料感染人和動(dòng)物，陳沁等[9]報(bào)道498份進(jìn)口的動(dòng)物源性飼料沙門氏菌陽性率為4.62%，周春紅等[10]對(duì)95份飼料進(jìn)行沙門氏菌分離時(shí)，檢出陽性率為5.26%，這也要求企業(yè)在寵物食品加工過程中對(duì)沙門氏菌應(yīng)進(jìn)行有效防范，從源頭斷絕沙門氏菌的污染可能。

目前寵物食品中沙門氏菌主要通過細(xì)菌分離、生化鑒定等傳統(tǒng)微生物學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)，存在檢測(cè)周期較長(zhǎng)、檢測(cè)過程煩瑣的弊端，無法適應(yīng)快速檢測(cè)的要求，同時(shí)對(duì)可疑菌落的選取存在主觀判斷性，容易出現(xiàn)漏檢，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求較高。而比較成熟的快速檢測(cè)沙門氏菌的方法有免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[11]、分子生物學(xué)技術(shù)[12]、電化學(xué)檢測(cè)方法[13]和生物傳感器檢測(cè)技術(shù)[14]等，研究對(duì)象主要是食品樣品中的沙門氏菌檢測(cè)，而對(duì)寵物食品中沙門氏菌快速檢測(cè)方法的報(bào)道較少，本研究針對(duì)寵物食品特殊基質(zhì)，優(yōu)化了沙門氏菌的測(cè)試流程，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)，降低了試驗(yàn)過程中因操作步驟復(fù)雜引起的誤差，與傳統(tǒng)的微生物法相比，具備良好的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。本研究檢測(cè)沙門氏菌的靈敏度可達(dá)到1.9 CFU/25 g，與賈俊濤和張秀芹等的研究結(jié)果一致[15-16]。研究同時(shí)表明，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法和傳統(tǒng)微生物法檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，可以推廣運(yùn)用于寵物食品中沙門氏菌的快速檢測(cè)。