萬小銘， 曾偉斌， 雷 梅， 陳同斌

1. 中國科學院地理科學與資源研究所， 北京 100101

2. 中國科學院大學， 北京 100049

引 言

中國面臨著嚴峻的土壤重金屬污染現(xiàn)狀， 其中砷污染由于其分布普遍性和危害嚴重性受到來自各領域的廣泛關(guān)注。 砷超富集植物蜈蚣草具有超強的砷吸收和富集能力， 生物量大， 被認為是修復砷污染土壤的理想植物材料。 基于蜈蚣草的砷污染土壤植物修復技術(shù)取得良好的修復效果[1]。 蜈蚣草是一種蕨類植物， 具有兩個彼此獨立生活的世代交替， 即單倍體的原葉體世代和雙倍體的孢子體世代。 成熟孢子體進行無性的減數(shù)分裂， 產(chǎn)生孢子， 孢子在濕潤基質(zhì)上產(chǎn)生小的線狀或葉狀的配子體(原葉體)。 原葉體成熟后， 出現(xiàn)性器官——精子器和頸卵器， 濕潤條件下受精， 發(fā)育成具有根、 莖、 葉的孢子體[2]。

目前所報道的所有蜈蚣草均具有砷超富集能力[3-4]， 并且該特性在多個連續(xù)世代能夠得到穩(wěn)定遺傳。 蜈蚣草是如何通過僅僅幾十個微米的孢子將這種砷超富集能力傳遞給下一代？ 同步輻射X射線熒光探針分析技術(shù)(synchrotron radiation X-ray fluorescence microprobe analysis)和同步輻射X射線吸收光譜(synchrotron radiation X-Ray absorption spectroscopy)是依托同步加速器產(chǎn)生的高能射線進行微區(qū)分析的手段[5-6]。 與其他微區(qū)分析手段相比， SRXRF分析靈敏度高、 操作簡便， 近年來被廣泛應用到超富集植物的研究中， 它也使得研究幾十個微米的孢子中As及其他元素的分布成為可能[7]。 本研究采用同步輻射X射線熒光光譜微區(qū)技術(shù)研究了蜈蚣草孢子中各種化學元素的組成， 包括大量營養(yǎng)元素鉀、 鈣、 鐵、 硫， 以及微量元素砷、 銅、 鋅在孢子囊中的形態(tài)分布。 同時， 砷作為一種變價元素， 存在價態(tài)顯著影響砷的遷移性和植物可利用性[8]， 砷在孢子中的主要存在形態(tài)目前還鮮有研究， 本文通過同步輻射X射線微區(qū)吸收近邊結(jié)構(gòu)(synchrotron radiation micro X-ray absorption near edge structure， SR μ-XANES)研究了砷在孢子中的存在形式， 并與羽葉和孢子囊中的砷形態(tài)進行對比。

1 實驗部分

1.1 樣品

溫室培養(yǎng)蜈蚣草， 選擇成熟羽葉的中部羽片的中部位置， 去離子水淋洗， 立即采用包埋劑包埋后冷凍， 在切片機上切片， 切片厚度選擇20 μm， 選擇切片時注意選擇帶孢子羽片， 密封保存在-30 ℃冰箱中待測。

1.2 方法

采用日立S-3000N型掃描電子顯微鏡獲得孢子囊的表面形貌， 選擇合適視野進行拍照觀察， 加速電壓為15 kV。 孢子囊微區(qū)元素分布的掃描在北京正負電子對撞機的4W1B同步輻射X射線熒光分析實驗站上進行。 測定時貯存環(huán)的電子能量為2.2 GeV， 束流強度為78～120 mA。 調(diào)節(jié)水平和垂直兩個狹縫， 將入射白光的光斑限為20 μm×20 μm， 樣品與入射光束成45°。 探測器為美國PGT Si(Li)固體探測器及能譜儀系統(tǒng)， 探頭的鈹窗厚度為7.5 μm， 能量分辨率為134 eV(5.89 keV處)。 探測器與樣品的距離根據(jù)得到的能譜信號進行調(diào)整， 樣品與探測器的距離分別為50 mm并保持在樣品的測試過程中固定不變。 通過450倍光學顯微鏡監(jiān)視樣品， 微機程控三維樣品移動平臺， 使X射線照射掃描點上， 移動平臺步進精度為1 μm·步-1。 每個掃描點測量時間為100 s， 測量的熒光信號輸入多道能譜儀， 得到同步輻射X射線微束激發(fā)植物樣品的能譜圖。 數(shù)據(jù)的分析采用WinQXAS軟件， 扣除背景值后計算各元素峰面積， 所獲得的元素計數(shù)用流強和電離室常數(shù)做歸一化處理。

孢子囊的微區(qū)砷形態(tài)在上海應用物理研究所上海光源BL15U1-硬X射線微聚焦及應用(微束)光束線站上進行。 測定時貯存環(huán)的電子能量為3.5 GeV， 采用熒光模式， 將光斑(約3 μm×5 μm)固定在孢子上， 進行近邊譜的收集。 As參比物質(zhì)選用液體的亞砷鈉、 砷酸二氫鈉、 用亞砷酸鹽和10倍摩爾比的還原性谷胱甘肽合成的As(Ⅲ)-GSH以及二甲基胂酸鈉(DMA)， 分別代表As(Ⅲ)， As(Ⅴ)， As(Ⅲ)-SH以及As(Ⅴ)-C， 濃度均為1 000 mg·L-1。 對獲得的X射線吸收近邊譜進行邊前背景扣除以及歸一化處理后， 選取能量為11 840～11 940 eV的近邊譜進行樣品主要組分線性組成分析。

2 結(jié)果與討論

孢子囊群著生在蜈蚣草羽葉背面葉緣， 可以看出孢子囊飽滿， 且大部分孢子仍然在孢子囊中， 尚未彈出(圖1)。

圖1 孢子囊掃描電鏡圖片

由圖2和圖3可以看出， 砷主要分布在孢子中， 最高計數(shù)達到1175， 而孢子囊中砷含量僅為200左右， 孢子中砷含量明顯高于孢子囊。 孢子中的砷的空間分布鮮有研究， 而本研究表明， 孢子中的砷計數(shù)明顯高于葉片。 在包括水稻、 小麥等的普通植物中， 重金屬往往主要分布在根系， 向地上部轉(zhuǎn)運比例較小， 而向種子中的遷移比例更小[9-10]。 蜈蚣草孢子具有較高濃度的砷這一現(xiàn)象產(chǎn)生的機制還不清楚。 蜈蚣草是否通過含有高濃度砷的孢子將砷耐性和富集能力傳遞到后代？ 這一問題還需要進一步研究揭示。

圖2 蜈蚣草中孢子及孢子囊掃描范圍示意圖

圖3 蜈蚣草孢子及孢子囊中的砷分布

進一步通過同步輻射X射線吸收光譜(近邊分析)表明， 孢子囊、 孢子中的砷形態(tài)與羽葉中一樣， 均以AsⅢ為主(圖4)。

圖4 蜈蚣草孢子囊、 孢子及羽葉中的砷形態(tài)

已有研究表明， AsⅢ是蜈蚣草地上部分砷的主要存在形態(tài)[11]， 但針對蜈蚣草孢子中砷的微區(qū)形態(tài)的研究還較少。 本研究首次揭示了蜈蚣草孢子中的砷形態(tài)也為AsⅢ。

本研究表明， 孢子和孢子囊中砷同樣以AsⅢ為主。 AsⅢ是砷形態(tài)中活性較強的一種形態(tài)。 砷超富集植物將大量的高毒性AsⅢ轉(zhuǎn)移到生殖細胞是否與其穩(wěn)定遺傳的砷富集能力有關(guān)？ 據(jù)報道， 蜈蚣草的孢子萌發(fā)后， 原葉體對砷具有極強耐性， 在添加砷為20 mmol·L-1的時候仍然表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)， 體內(nèi)能富集超過2.5%的砷[12]。 在孢子產(chǎn)生和萌發(fā)過程中高活性的砷所發(fā)揮的作用還有待進一步研究。 鉀的分布與砷的分布不完全相似， 在孢子囊中鉀的相對計數(shù)高于孢子， 右上角由于存在孢子囊和孢子的重疊， 導致砷和鉀在圖中右上角都含量較高。 有研究認為， 在蜈蚣草中砷和鉀的分布呈現(xiàn)高度相似性， 表明砷和鉀在蜈蚣草中可能進行協(xié)同運輸， 這可能是蜈蚣草超富集砷的機理之一[13]。 而對孢子和孢子囊的微區(qū)分析表明， 砷和鉀在孢子和孢子囊中的分布并不完全相似。 鈣的分布與砷的分布具有一定程度的相似性， 孢子中的鈣含量明顯高于孢子囊。 蜈蚣草是鈣質(zhì)土的指示植物， 中國的蜈蚣草有50%都分布在鈣質(zhì)土壤上， 孢子中也具有相對較高的鈣含量。 這表明蜈蚣草孢子的萌發(fā)對鈣有特殊需求， 鈣可能在孢子萌發(fā)過程中對其極化分裂具有重要意義。 同時， 鈣的添加能夠促進原葉體的生長和對砷的累積[12]。 砷和鈣的微區(qū)沉淀以及砷在毛狀體的聚集是蜈蚣草解砷毒的重要方式[14]。 鈣在蜈蚣草生命周期中所發(fā)揮的作用及其與砷累積過程的交互作用還需進一步研究。 研究還對植物必需元素鐵、 硫、 銅和鋅在孢子和孢子囊中的微區(qū)分布進行了測定， 結(jié)果表明， 硫在孢子囊的局部區(qū)域集中分布， 與砷的分布具有一定程度的相似性。 其他元素均無明顯規(guī)律。

對蜈蚣草孢子囊中砷(圖3)和其他元素的分布研究表明， 與成熟植株中砷和鉀具有相似分布的趨勢不一樣[13]， 孢子囊中砷和硫[圖5(a)]的分布沒有明顯相似性， 相反， 砷和鈣[圖5(b)]、 砷和硫[圖5(d)]具有更多的相似性， 砷和硫、 砷和鈣更有可能同時聚集在孢子中。 這表明， 在蜈蚣草產(chǎn)生孢子， 和孢子萌發(fā)過程中， 砷、 硫和鈣可能都發(fā)揮著重要作用。 這為我們后續(xù)研究提供了重要的思路。

圖5 蜈蚣草孢子及孢子囊中的元素分布

3 結(jié) 論

蜈蚣草的微區(qū)元素分布研究表明， 孢子囊中砷和鈣、 砷和硫具有相似性， 砷和硫、 砷和鈣更有可能同時聚集在孢子中。 在微區(qū)砷形態(tài)方面， 與羽葉一致， 孢子和孢子囊中砷都以AsⅢ為主。 AsⅢ是砷形態(tài)中活性較強的一種形態(tài)。 砷超富集植物將大量的高毒性AsⅢ轉(zhuǎn)移到生殖細胞的過程與其穩(wěn)定遺傳的砷富集能力之間的關(guān)系， 以及孢子萌發(fā)過程中高活性的砷所發(fā)揮的作用還有待進一步研究。