畢雅雯， 劉 晶， 蔣 艷， 涂勇剛， 董世建， 徐明生*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制工程實驗室，江西 南昌 330045；2.安徽榮達食品有限公司，安徽 宣城 242228）

蛋黃具有很高的營養(yǎng)價值和功能特性，其質(zhì)量約占雞蛋總質(zhì)量的28%~29%。蛋黃含有蛋黃卵磷脂、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、卵黃高磷蛋白、卵黃蛋白等表面活性成分，并且具有很強的天然乳化性，對油脂和水有很強的親和力，是制造焙烤食品、乳飲料及冰激凌時起乳化作用的重要配料[1]。但是蛋黃的乳化性會受其加工方法的影響，如降低蛋黃濃度可導致乳液的乳化性下降，乳液易分層或析油，對產(chǎn)品的外觀及保質(zhì)期易造成不良影響，限制了蛋黃乳液在實際生產(chǎn)中的應用[2]。因此，改善蛋黃乳化性具有重要的意義。

研究表明，蛋黃蛋白對乳化性的貢獻高于磷脂，針對蛋白質(zhì)改性來提升蛋黃乳液的乳化性是研究熱點。如秦鳳嬌等[3]發(fā)現(xiàn)磷酸鹽作用于蛋黃后，蛋黃的電負性增強，油滴間的靜電排斥作用提高，乳液的穩(wěn)定性得到改善；Xu等[4]使用辛烯基琥珀酸酐（OSA）淀粉破壞了蛋黃蛋白聚集體，提高了油水界面的吸附率以達到穩(wěn)定蛋黃乳液的作用；Yan等[5]采用高靜水壓力誘導蛋黃蛋白展開，使其更易吸附于油水界面，改善了蛋黃的乳化性。近年來，由于蛋白質(zhì)具有兩親性，能夠擴散和吸附到油水界面上，形成穩(wěn)定的界面蛋白膜，而被廣泛用作乳化劑，增強乳液的乳化性[6]。而SPI是一種由大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白組成的剛性球狀蛋白，具有良好的乳化性，主要作為加工助劑用于乳液中[7]。如大豆分離蛋白作用于乳清分離蛋白，發(fā)現(xiàn)復合物的乳化性相比單一的乳清分離蛋白得到更好改善，且乳液的粒徑更小，靜電排斥力更強[8]。除乳化劑影響乳液的乳化性外，超聲功率也是影響乳液乳化性的重要因素。超聲波改變蛋白質(zhì)乳化性主要通過聲空化效應形成局部極端物理力，引起食品系統(tǒng)中的一些物化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)變化[9]。如Xie等[10]通過超聲處理蛋黃使蛋黃低密度脂蛋白部分聚集，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)拉伸和局部構(gòu)象變化，提高了蛋黃乳液的乳化性；王喜波等[11]利用超聲波改變大豆分離蛋白-乳清蛋白乳液的乳化性和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)超聲處理輔助大豆分離蛋白，可以進一步改善乳清蛋白的乳化性，使乳液具有更大的表面電荷和更小的粒徑，形成更穩(wěn)定的乳液。但是有關(guān)SPI改善蛋黃乳液乳化性以及SPI輔以超聲處理改善蛋黃乳液乳化性的影響尚不清楚。

作者以新鮮蛋黃為原料，研究SPI對蛋黃乳化性的影響，并在此基礎(chǔ)上進一步研究不同超聲功率對EY-SPI乳化性的影響，為改善蛋黃乳液類產(chǎn)品的生產(chǎn)及應用提供一定理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋：市售；SPI（食品級，純度>98%）：臨汐山松生物制品有限公司產(chǎn)品；尼羅紅：美國Sigma試劑公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

超微聲波細胞粉碎儀：寧波新藝有限公司產(chǎn)品；Zetasizer Nano ZS90粒子分析儀：美國Malvern公司產(chǎn)品；T25分散機：德國IKA公司產(chǎn)品；OLYMPUS倒置熒光顯微鏡：奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機：上海安亭儀器公司產(chǎn)品；V-5600型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 乳液的制備將1 g的SPI、EY、EY-SPI粉末分別溶于99 g的去離子水中，25℃下磁力攪拌2 h，使其充分溶解，放置過夜，將EY、SPI、EY-SPI溶液和大豆油按體積比7∶3混合，10 000 r/min下高速剪切2 min，得到EY、SPI和EY-SPI乳液。

1.3.2 超聲處理分別采用0、150、300、450 W的超聲功率，將制備好的EY、SPI、EY-SPI乳液處理8 min。在超聲波處理整個過程中，將溫度控制在25～35℃。

1.3.3 乳化活性與乳化穩(wěn)定性的測定參考Xie等[12]的方法，略做修改。從底部吸取50 μL乳液，與5 mL的0.1 g/dL SDS溶液混合，用可見分光光度計在波長500 nm處測定吸光度。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）的計算公式如下：

式中：A0為勻漿后的吸光度；N為稀釋因子，100；C為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL；F為原油乳狀液的體積分數(shù)（0.25）；A10為10 min后乳液的吸光度。每個樣品測量并重復3次。

1.3.4 乳析指數(shù)的測定將未超聲和超聲處理的乳液放置在密封管中，25℃保存14 d，每天測量乳液的乳化量。乳析指數(shù)的計算公式如下：

式中：H為乳析指數(shù)，%；Hc為底部透明液層高度，cm；He為總?cè)橐焊叨?，cm。

1.3.5 粒徑的測定參考文獻[13]的方法，略做修改。分散介質(zhì)的折射率為1.330，吸收指數(shù)為0.001，分散液滴的折射率為1.456。測定前，用PBS溶液將乳液稀釋250倍，以避免多次散射。對每個記錄進行10多次掃描，每個樣本進行3次測量。

1.3.6 Zeta電位的測定參考文獻[14]的方法，略做修改。乳液的Zeta電位是根據(jù)激光多普勒電泳遷移率理論，在25℃下使用粒子分析儀測定，每個樣本測量3次。乳液在測定前，用PBS溶液稀釋2 000倍。對每條記錄進行15次以上掃描，每個樣本進行3次測量。

1.3.7 溶解度的測定參考文獻[15]的方法，略做修改。準確稱取30 g樣品溶液，使用高速冷凍離心機在4℃條件下以10 000 r/min離心30 min。離心后，取上清液用BCA蛋白質(zhì)定量法在562 nm處測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。溶液中總蛋白質(zhì)含量通過凱氏定氮法測定?？扇苄缘鞍踪|(zhì)的溶解度通過以下公式計算：

式中：C為可溶性蛋白質(zhì)的溶解度，%；C1為上清液中蛋白質(zhì)含量；C2為蛋黃中總蛋白質(zhì)含量。

1.3.8 界面蛋白吸附量的測定參考文獻[16]的方法，略做修改。取新鮮乳液30 mL于50 mL離心管中，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，乳液被分為上層乳析相和下層水相。將離心管在-40℃下冷凍8 h，固定上下相，然后使用刀片將上層乳析相去掉，剩余的下層水相使用0.22 μm濾膜過濾，采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。界面蛋白吸附量按照下式進行計算：

式中：K為界面蛋白吸附量，g/g；M為乳液中總蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；M1為下層水相蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；M2為乳液中油的質(zhì)量，g。

1.3.9 SDS-PAGE電泳分析參考文獻[17]的方法，略做修改。取新鮮乳液30 mL于50 mL離心管中，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，乳液被分為上層乳析相和下層水相。將離心管在-40℃下冷凍8 h以固定上下相，將上下相分離。取約1 g上層乳析相（界面蛋白），質(zhì)量濃度調(diào)整為2 mg/mL，進行煮沸。采用體積分數(shù)5%濃縮膠（80 V）和體積分數(shù)12%分離膠（120 V）進行電泳分析。

1.3.10 微觀結(jié)構(gòu)的測定參考文獻[18]的方法，略做修改。采用熒光顯微鏡觀察新鮮乳液的形態(tài)，將40 μL尼羅紅染料加入至2 mL乳液中，進行染色，拍攝圖片。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析所有的樣品進行3次測定，計算平均值。使用Origin 8.0和Excel 2013分析所有數(shù)據(jù)。使用SPSS 19.0進行方差分析，顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化活性與乳化穩(wěn)定性

如圖1所示，在EY中添加SPI，可以顯著提高EY的乳化活性和乳化穩(wěn)定性（P<0.05），表明在蛋黃中添加SPI可顯著改善蛋黃的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。超聲處理后EY、SPI、EY-SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著提高（P<0.05）；當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的乳化穩(wěn)定性最好（P<0.05），表明適當?shù)某暪β士梢暂o助SPI顯著改善蛋黃的乳化穩(wěn)定性（P<0.05）；隨著超聲功率的增強，乳液的乳化穩(wěn)定性降低。超聲功率超過150 W后超聲功率對EY-SPI的乳化活性影響不顯著。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白作用于SPI，WPI-SPI復合物的界面蛋白吸附量增加和油滴間的靜電排斥力增強，乳液的乳化穩(wěn)定性提高，所以EY-SPI乳液的乳化穩(wěn)定性增強也有可能是由于油水界面的吸附量和表面電荷分布發(fā)生變化所引起的。超聲處理后，通過聲空化效應產(chǎn)生的物理力，乳液的粒徑減小，進一步改善其乳化活性和乳化穩(wěn)定性；而150 W的超聲功率可以改變EY-SPI在油水界面的分布，從而顯著提高EY-SPI的乳化穩(wěn)定性[20]；但在超聲處理過程中，顆粒的破碎和重聚同時發(fā)生，超聲功率過高時，蛋白質(zhì)之間重聚現(xiàn)象出現(xiàn)，所以乳液的乳化穩(wěn)定性在一定程度上下降[21]。

圖1 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI乳化特性Fig.1 Emulsification characteristics of EY，SPI and EYSPI under different ultrasonic power

2.2 乳液的乳析指數(shù)

為了進一步考察乳液的乳化穩(wěn)定性，測定了第1天和第14天乳液的乳析指數(shù)和外觀圖。乳液貯存1 d的外觀圖和乳析指數(shù)見圖2（a）、（b），EY-SPI乳液的乳析指數(shù)顯著低于EY和SPI乳液（P<0.05），表明EY-SPI乳液中，液滴之間的斥力作用強度高于EY、SPI乳液，液滴才有規(guī)則地分布并緊密堆積使乳脂層加厚，乳析指數(shù)降低[22]。超聲處理后乳液的乳析指數(shù)顯著降低（P<0.05），該變化趨勢與乳液的乳化穩(wěn)定性變化相反，表明超聲處理可以顯著改善乳液的乳化穩(wěn)定性（P<0.05），但是隨著超聲功率的增強，乳液的乳析指數(shù)未發(fā)生顯著性變化，具體原因還需進一步研究。

乳液貯存14 d的外觀圖和乳析指數(shù)如圖2（c）、（d）所示，SPI、EY-SPI乳液的乳析指數(shù)顯著高于EY乳液（P<0.05），可能是因為隨著貯存時間的延長，SPI、EY-SPI乳液中的蛋白質(zhì)開始聚集，界面蛋白吸附量減少，乳液的乳脂層厚度較小，乳析指數(shù)增加。超聲處理后，乳液的乳析指數(shù)顯著減小（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液未發(fā)生相分離，乳析指數(shù)為0，乳液最穩(wěn)定，說明超聲處理可以輔助SPI顯著提高蛋黃的乳化穩(wěn)定性（P<0.05），該結(jié)果與2.1中乳化穩(wěn)定性的研究一致。

圖2 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI乳析指數(shù)Fig.2 Emulsification index of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.3 乳液的粒徑

乳液粒徑大小對乳液的穩(wěn)定性有很大的影響，一般乳滴的直徑越小，乳液的穩(wěn)定性越強。乳液的粒徑變化如圖3所示，EY-SPI乳液的粒徑顯著高于EY和SPI乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI，EY-SPI乳液中可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集體。超聲處理后乳液粒徑顯著減小（P<0.05），當超聲功率為150 W，EY-SPI乳液的粒徑最?。≒<0.05），說明適當?shù)某暪β士梢燥@著減小乳液的粒徑（P<0.05），使蛋黃乳液達到穩(wěn)定的狀態(tài)；隨著超聲功率的增強，SPI、EY-SPI乳液的粒徑增大，EY乳液的粒徑減小。超聲處理后，由于超聲的聲空化效應，產(chǎn)生了湍流和高剪切力，加劇了油滴的破裂，從而使乳液的粒徑減小[23]；而150 W的超聲處理使得EY-SPI中蛋白質(zhì)更容易吸附在乳液表面，蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生空間位阻作用，抑制了EY-SPI乳液液滴之間的相互作用，進一步減小乳液的粒徑[24]；但是高強度的超聲功率可以產(chǎn)生較大湍流力和微流體，增加碰撞和聚集的速度，導致蛋白質(zhì)聚集體的形成，使乳液的粒徑增大[25]。

圖3 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI粒徑Fig.3 Particle size of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.4 乳液的微觀結(jié)構(gòu)

微觀結(jié)構(gòu)是表征乳液顆粒大小、分散性、不穩(wěn)定性的指標。如圖4所示，采用倒置熒光顯微鏡對其微觀結(jié)構(gòu)進行分析，綠色熒光代表油脂。超聲功率為0 W時，乳液的液滴尺寸較大，聚集情況嚴重。而經(jīng)過超聲處理后，乳液的液滴尺寸顯著減小，液滴呈規(guī)律的球形狀態(tài)，少有聚集情況；當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的液滴尺寸最小且分布均勻。表明超聲處理可以減小乳液的粒徑大小，并且包裹油滴的界面蛋白之間產(chǎn)生較強的空間阻力，形成規(guī)則的球形[26]；150 W的超聲處理使EY-SPI蛋白在油水界面形成更加致密的膜結(jié)構(gòu)，減少了液滴的聚集。

圖4 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.5 乳液的界面蛋白吸附量

界面蛋白的吸附能力對乳液聚集穩(wěn)定有重要影響。如圖5所示，EY-SPI乳液的界面蛋白吸附量顯著高于EY、SPI乳液（P<0.05），表明EY、SPI等質(zhì)量混合，可以使乳液的界面蛋白吸附量增加。超聲處理后乳液的界面蛋白吸附量顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的界面蛋白吸附量顯著高于EY乳液（P<0.05）。隨著超聲功率的增強，乳液的界面蛋白吸附量降低。EY-SPI乳液界面蛋白吸附量增加可能是由于加入SPI，更多的蛋白質(zhì)吸附于油水界面，油滴被更好的包裹，防止了油滴的聚集和絮凝，提高了乳液的穩(wěn)定性[27]；由于超聲處理使蛋白質(zhì)顆粒減小，更易吸附于油水界面，乳液的界面蛋白吸附量增加；150 W的超聲功率可以使更多的EY-SPI蛋白吸附于油水界面，增強了液滴之間的靜電排斥力，從而使EY-SPI乳液的乳化穩(wěn)定性提高。超聲功率超過150 W時，乳液的界面蛋白吸附量開始下降，可能是由于過高的超聲功率使蛋白質(zhì)發(fā)生自聚集行為，在油水界面的伸展吸附作用減弱[28]。

圖5 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI界面蛋白吸附量Fig.5 Interfacial protein adsorption capacity of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.6 乳液的界面蛋白組成

蛋黃乳液主要由蛋白質(zhì)形成并進行穩(wěn)定，而不同蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的能力也有所差異[29]，為此利用SDS-PAGE電泳分析乳液的界面蛋白組成變化情況。由于各組界面蛋白均稀釋了同樣的倍數(shù)，條帶的深淺一定程度代表其界面蛋白含量的高低，條帶的數(shù)量代表界面蛋白的種類。如圖6所示，泳道5~8為EY界面蛋白條帶，主要是低密度脂蛋白（相對分子質(zhì)量分別為2.20×105、1.10×105~1.80×105和5.00×104）以及卵黃球蛋白（3.8×104~4.0×104）。泳道9~12為SPI界面蛋白條帶。與泳道5~8相比，泳道1~4 EY-SPI出現(xiàn)了一些新條帶，主要是3.4×104和1.5×104，這些新增條帶與泳道9~12的條帶基本一致，說明添加SPI后，EY-SPI乳液中的蛋白質(zhì)共同吸附于油水界面，使EY-SPI乳液的界面蛋白的吸附量顯著高于EY乳液。隨著超聲功率的增強，乳液條帶顏色加深，表明超聲處理可以使更多的蛋白質(zhì)吸附于油水界面，乳液的乳脂層加厚，乳液液滴的靜電排斥力增強，乳化穩(wěn)定性提高[30]。

圖6 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI界面組成Fig.6 Interface composition of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.7 乳液的Zeta電位

通過測量乳液Zeta電位，研究了靜電作用對蛋白質(zhì)乳液穩(wěn)定性的影響。如圖7所示，EY-SPI乳液的Zeta電位顯著高于EY乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI可顯著增強蛋黃的靜電排斥力。超聲處理后乳液的Zeta電位顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的靜電排斥力最強（P<0.05）。EY-SPI乳液的Zeta電位比EY乳液的高，可能是由于SPI的加入，使更多的蛋白質(zhì)吸附到乳液液滴表面，增大了油滴的表面電荷，增強了液滴間的排斥力，提高了乳液的穩(wěn)定性[31]。超聲處理后，EY-SPI乳液的Zeta電位增大可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)折疊分解，暴露了更多的親水基團，增強了表面電荷密度，增大了乳滴之間的靜電排斥力，提高了乳液的穩(wěn)定性[32]，而適當?shù)某暪β士梢允垢嗟牡鞍踪|(zhì)吸附于油水界面，形成較厚的乳脂層，增強液滴間的靜電排斥力。

圖7 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI電位Fig.7 Electric potential of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.8 蛋白質(zhì)的溶解度

蛋白質(zhì)的溶解度是影響乳液性質(zhì)的一個重要因素。一般認為，蛋白質(zhì)的溶解度較大時，蛋白質(zhì)在溶液或者兩相界面發(fā)揮的作用較大，乳化性較好。如圖8所示，EY-SPI乳液的蛋白質(zhì)溶解度顯著高于EY乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI可顯著增強蛋黃蛋白的親水性。超聲處理后乳液的蛋白質(zhì)溶解度顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的蛋白質(zhì)溶解度最高（P<0.05）。蛋白質(zhì)溶解度的增加可歸因于超聲處理降低了EY-SPI的粒徑，增強了蛋白質(zhì)與水的相互作用，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解度[33]；也可能是由于蛋黃蛋白分子在超聲作用中部分展開，變得更易溶解，更易與SPI發(fā)生相互作用，在乳化過程中能夠快速吸附到油水界面，形成穩(wěn)定的乳狀液[34]。

圖8 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI溶液中蛋白質(zhì)溶解度Fig.8 Solubility of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

3 結(jié)語

添加SPI后，EY乳液的Zeta電位增大，界面蛋白吸附量提高，有效改善了EY的乳化性。而當150 W超聲功率作用于EY-SPI乳液時，蛋白質(zhì)聚集體破碎，形成了小的可溶性蛋白質(zhì)聚集物，在乳化過程中迅速吸附在油水界面，形成了較厚的界面蛋白膜，提高了靜電排斥力，乳液粒徑最小，分布均一，乳液更穩(wěn)定。