趙 赟， 蔡伊娜， 張存政， 彭池方*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 南京 210014）

戊唑醇（Tebuconazole，TEB）是一種廣譜、高效、低毒且藥效持續(xù)時間長的新型三唑類殺菌劑[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛，可以控制蔬菜、水果和谷物的病原真菌，以保證農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。然而，殺菌劑的濫用存在巨大的危害，如對人體健康的潛在危害以及農(nóng)產(chǎn)品、土壤和水中的殘留對環(huán)境造成污染[2]。盡管已經(jīng)有許多方法可實現(xiàn)TEB的高靈敏度檢測，如高效液相色譜法[3]和氣相色譜法[4]等，但是這些方法存在儀器昂貴、檢測煩瑣、耗時和要求專業(yè)人員等限制，使其難以實現(xiàn)TEB的現(xiàn)場檢測。因此，開發(fā)高靈敏、低成本的戊唑醇檢測方法具有重要意義。

免疫層析技術（Lateral flow immunoassay，LFIA）是一種基于色譜層析技術和納米標記物[5]的即時檢測技術。目前，基于納米材料的改性或修飾是提高LFIA檢測性能的重要途徑之一[6]。例如多巴胺（Dopamine，DA）作為一種穩(wěn)定的功能化修飾材料受到廣泛關注。Xu等[7]使用H2O2輔助DA氧化聚合為聚多巴胺（Polydopamine，PDA），成功在金納米顆粒（Gold nanoparticles，AuNPs）表面修飾不同厚度的PDA殼層，提高了與玉米烯酮抗體偶聯(lián)的穩(wěn)定性和檢測靈敏度。Choi等[8]在堿性條件下使DA自聚合到AuNPs表面，并利用PDA良好的黏附性，將熒光標記的發(fā)夾DNA鏈固定在表面。Liu等[9]通過將PDA修飾到AuNPs表面，成功將CuInZnS量子點結合在該復合材料表面，AuNPs-PDA核殼結構不僅增強了電化學發(fā)光強度，而且大大削減了熒光淬滅的程度。量子點（Quant dot，QD）具有穩(wěn)定性強，熒光發(fā)射強度高和發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點，常被作為標記物來提高LFIA的靈敏度和穩(wěn)定性[10]。例如高曉龍等[11]將羧基化CdSe/ZnS量子點與犬細小病毒單克隆抗體5G7共價偶聯(lián)，制備出量子點免疫層析試紙條，其靈敏度達到1×103TCID50/mL，顯著高于傳統(tǒng)膠體金試紙條。Sheng等[12]根據(jù)ZnCdSe/ZnS量子點的淬滅機理，將代表陽性的消線信號轉(zhuǎn)換為顯線信號，顯著提高了四環(huán)素類抗生素檢測的裸眼檢出靈敏度。

本研究中通過H2O2輔助制備Au@PDA，并以Au@PDA為熒光淬滅體，以噴涂在T線上的ZnCdSe/ZnS量子點作為熒光供體，構建了一種基于反向熒光增強的雙信號放大免疫層析模型，實現(xiàn)了對戊唑醇的快速半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯金酸、卵清蛋白、多巴胺鹽酸鹽（DA·HCl）、檸檬酸三鈉：上海國藥控股化學試劑有限公司產(chǎn)品；戊唑醇：Sigma公司產(chǎn)品；表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子點：世紀珈源量子點技術有限公司產(chǎn)品；戊唑醇單克隆抗體：作者所在實驗室制備；實驗用水均為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水，其余試劑均為市售分析純。

ZQ2000微電腦自動斬切機：上海金標生物科技有限公司產(chǎn)品；GT-710手持式食品安全分析儀：北京勤邦生物技術有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計：江蘇貝普科學儀器有限公司產(chǎn)品；WH220-R磁力攪拌器：北京維根技術有限公司產(chǎn)品；ZX1000三維噴點平臺：上海百道貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機：中國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 AuNPs和Au@PDA的合成

參照文獻[13]中制備方法。將實驗所用的三角瓶、攪拌子用重鉻酸和濃硫酸混合液浸泡過夜，然后用蒸餾水反復沖洗，再用超純水漂洗，烘干待用；準確量取99.5 mL的超純水于三角瓶中，加入500 μL質(zhì)量分數(shù)2%的氯金酸溶液，攪拌均勻后加熱；待溶液沸騰后一次性加入5 mL的1 g/dL檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，當溶液顏色穩(wěn)定時，停止加熱，慢速攪拌30 min后取下，自然冷卻至室溫后存放到4℃冰箱保存待用。

參考文獻[14]中合成方法，稍做改動。取1 mL制備好的AuNPs溶液，10 000 r/min離心30 min，并使用Tris-HCl（pH 9）重懸，加入4 μL體積分數(shù)為3% H2O2充分攪拌均勻，分別加入10、20、30 μL 5 mg/mL DA·HCl（分別記為Au@PDA-50、Au@PDA-100、Au@PDA-150），室溫下避光反應1 h，待溶液由酒紅色變?yōu)榧t褐色后10 000 r/min離心30 min，并加入超純水復溶，放置4℃冰箱待用。

1.3 Au@PDA-mab的制備

取1 mL上述制備得到的Au@PDA溶液，使用0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至7，置于磁力攪拌器上并緩緩加入7 μg戊唑醇單克隆抗體；避光反應1 h后加入10 μL質(zhì)量分數(shù)20%BSA封閉30 min，封閉完成后10 000 r/min離心30 min，去除上清液后加入100 μL超純水復溶。

1.4 量子點-卵清蛋白（QDs-OVA）的合成

參照文獻[15]中偶聯(lián)方法，稍做改動。具體如下：取100 μL表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子點（8 μmol/L），以50 mmol/L的硼酸緩沖液（pH 6）稀釋至600 nmol/L，加入0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至5~6，慢速攪拌條件下加入15 μL 10 mg/mL EDC溶液，室溫下避光反應4 h；隨后加入1.8 mg卵清蛋白，繼續(xù)反應過夜至反應結束后置于4℃儲存。

1.5 免疫層析試紙條的組裝

免疫層析試紙條主要由樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、聚氯乙烯底板（PVC底板）和吸水墊5部分組成（見圖1）。將玻璃纖維膜裁成長度15 mm的長條作為樣品墊，經(jīng)處理液浸泡后37℃烘干。將玻璃纖維膜切成長度6 mm的長條作為金標墊，并使用處理液浸泡后37℃烘干。將Au@PDA-mab探針噴涂在金標墊于37℃烘箱烘干30 min后備用。將吸水墊裁成長度10 mm的長條，按圖1所示將各部分組裝完畢。使用劃膜機將包被原和量子點-卵清蛋白復合物的混合物噴涂在NC膜上作檢測線（T線），將羊抗小鼠二抗噴涂在NC膜上作為控制線（C線），兩線間距6 mm。烘干后，使用自動斬切機裁成長度4 mm的長條，置于37℃下烘干6 h后裝入含有干燥劑的封口袋中待用。

圖1 雙信號免疫層析試紙條的結構示意圖Fig.1 Schematic illustration of immunochromatographic test strip

1.6 反應條件的優(yōu)化

基于雙信號讀取模式，先對Au@PDA裸眼比色模式的條件進行優(yōu)化，以T線顏色的色差為指標，對PDA層厚度、pH、抗體加入體積和包被原（TEBBSA）質(zhì)量濃度進行條件優(yōu)化；隨后，在紫外光照射條件下，繼續(xù)對量子點濃度和探針體積作為優(yōu)化條件，以熒光恢復最小濃度為優(yōu)化指標，得出最佳參數(shù)。

式中：ΔPPI為在陽性條件下和陰性條件下，試紙條上T線讀取到的信號的差值；PPI0為在陰性條件下檢測時，T線條帶的像素分辨率；PPI1為在陽性條件下檢測時，T線條帶的像素分辨率

2 結果與討論

2.1 AuNPs和Au@PDA的表征

如圖2所示，通過DA聚合反應，在AuNPs表面可形成均勻的殼層。殼層的厚度隨著DA加入量的增加而增加，并且，其吸光度也有顯著增加（見圖3），這有利于試紙條比色信號的增強。DA對AuNPs的包裹，是由于DA在堿性條件下很容易氧化自聚合形成PDA，并且具有非常強的黏附作用[16]，而這源于其表面含有豐富的3，4-二羥基-L-苯丙氨酸（DOPA）和賴氨酸[17]。并且，上述Au@PDA對抗體的結合也不同于傳統(tǒng)膠體金通過靜電吸附標記抗體，而是通過PDA借助表面較強的奎寧-氨基作用，以及邁克爾加成反應[18]，使得與抗體偶聯(lián)更加穩(wěn)定。

圖2 AuNPs和Au@PDA的TEM圖Fig.2 TEM images of AuNPs and Au@PDA

圖3 AuNPs/Au@PDA和QD的紫外吸收光譜和熒光光譜Fig.3 UV-vis and fluorescence spectra of AuNPs/Au@PDA and QD

表面羧基化的量子點通過活潑酯法將卵清蛋白偶聯(lián)到量子點表面。當Au@PDA距離QDs-OVA足夠近時，QDs發(fā)出的熒光強度將會顯著下降甚至淬滅，這是由于Au@PDA的紫外吸收光譜特征峰和量子點的發(fā)射光譜特征峰重疊程度大（見圖3），導致量子點發(fā)出的熒光被Au@PDA吸收，即發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）[15]。所設計比色和熒光雙信號檢測試紙條的檢測原理如下：當樣品中不含有戊唑醇時，T線噴涂的包被原捕獲Au@PDA探針，F(xiàn)RET作用下熒光被淬滅，如圖4（a）所示；而當樣品中存在目標物時，競爭作用下結合到T線上的Au@PDA數(shù)量減少，熒光逐漸恢復，如圖4（b）所示。

圖4 試紙條熒光檢測的原理Fig.4 Principle of fluorescent detection with LFIA strip

2.2 反應條件的優(yōu)化

2.2.1 PDA層厚度的影響向1.2中AuNPs溶液里分別加入50、100、150 μg的DA，反應結束后測定紫外吸收峰（見圖3）分別在525、531、537 nm處，且溶液顏色逐漸加深，制備的AuNPs模板特征峰在518 nm處；隨后，從TEM表征中（見圖2）可測出殼層厚度分別為2.0、3.5、4.2 nm，當PDA層厚度為3.5 nm時（DA加入質(zhì)量100 μg），檢測線的像素值差ΔPPI最高（見圖5）。應用Au@PDA提高了試紙條檢測的信號響應，這可主要歸結于兩方面：一方面PDA修飾金納米顆粒使其比表面積增大，增加納米粒子表面吸附的抗體量；另一方面，所得到的Au@PDA的吸光度增加。因此選用加入質(zhì)量為100 μg作為DA最佳加入量。

圖5 比色檢測模式條件下PDA層厚度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of thickness of PDA layer in colorimetric detection mode

2.2.2 抗體加入體積的影響當Au@PDA表面標記抗體足夠時，探針才會足夠穩(wěn)定不至于在鹽溶液中發(fā)生聚沉[19]，但過量的抗體不僅會造成抗體的浪費，同時也會降低對戊唑醇的響應。如圖6所示，當抗體加入體積超過10 μL時，ΔPPI逐漸下降，因此選用抗體加入體積10 μL為最優(yōu)條件。

圖6 比色檢測模式條件下抗體加入量的優(yōu)化Fig.6 Optimization of amounts of antibody in colorimetric detection mode

2.2.3 pH的影響抗體偶聯(lián)標記物的環(huán)境是影響抗體標記物效果的重要因素之一，對于靜電吸附而言，pH達到抗體等電點時最適合抗體的標記，但由于PDA與抗體發(fā)生的是共價鍵的結合，如圖7所示，可以看到pH為7時ΔPPI最大，隨著pH逐漸升高PPI0逐漸下降，說明邁克爾加成反應不適于在堿性條件下進行，因此，pH為7時是標記抗體的最佳環(huán)境。

圖7 比色檢測模式條件下pH的優(yōu)化Fig.7 Optimization of pH in colorimetric detection mode

2.2.4 包被原質(zhì)量濃度的影響當T線上包被原質(zhì)量濃度過高時，T線上就會吸附過多的探針，從而導致陽性檢測時T線信號值響應程度下降。由圖8可以看出，當T線上包被原質(zhì)量濃度從0.25 mg/mL逐漸增大到1.00 mg/mL時，PPI0逐漸增大，捕獲到的探針數(shù)量增多，但ΔPPI在0.50 mg/mL質(zhì)量濃度條件下達到最高，說明包被原質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL條件下最利于目標物的檢出。

圖8 比色檢測模式條件下TEB-BSA質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.8 Optimization of concentration of TEB-BSA in colorimetric detection mode

2.2.5 量子點和Au@PDA-mab探針負載量的影響在上述優(yōu)化條件下，選取了3個濃度的量子點和金標墊上不同體積的探針相互作用，如圖9所示，當T線上噴涂量子點濃度為300 nmol/L時，紫外光照射條件下，只能在干燥的條帶上讀取微弱的熒光信號，而當樣品加入后，量子點熒光信號被背景值覆蓋（見圖9（a））；當量子點濃度為900 nmol/L時，紫外光照射條件下能夠清楚的識別出熒光信號，但是隨著探針體積的增多，并不能觀察到熒光淬滅的現(xiàn)象，即使探針最大加入體積達到3 μL依舊無法完全淬滅（見圖9（c））；而當量子點濃度調(diào)整為600 nmol/L時，不僅能夠清楚地辨別出T線上的熒光條帶，同時在探針體積加到3 μL時可以觀察到熒光剛好被淬滅，因此3 μL探針體積和600 nmol/L量子點濃度為最適熒光淬滅體積和濃度。

圖9 Au@PDA對量子點淬滅效應的優(yōu)化Fig.9 Optimization of the quenching effect of Au@PDA toward quantum dots

2.3 試紙條的檢測靈敏度

在上述最優(yōu)反應條件下，利用Au@PDA對QDs的熒光淬滅作用，將戊唑醇質(zhì)量濃度的負反饋信號轉(zhuǎn)換為正反饋信號，結合Au@PDA本身裸眼比色，構建出一種雙信號讀取方法來檢測農(nóng)藥殘留物戊唑醇。以含有體積分數(shù)5%甲醇的PBS緩沖溶液作為溶劑，對戊唑醇標準品梯度稀釋配置一系列質(zhì)量濃度溶液；兩種信號讀取方式中，均以裸眼能夠觀察到消線或顯線的最小質(zhì)量濃度作為定性檢測限（見圖10），在裸眼比色條件下，當戊唑醇質(zhì)量濃度達到1 μg/mL時T線消失，因此1 μg/mL為裸眼比色的檢測限。在紫外光照射條件下，隨著戊唑醇質(zhì)量濃度的升高熒光強度也逐漸升高，裸眼觀察到T線熒光出現(xiàn)的最小質(zhì)量濃度為100 ng/mL，因此100 ng/mL為熒光檢測的定性檢測限。以上結果表明，裸眼檢測時，熒光檢測比比色檢測的靈敏度提高了10倍。關于戊唑醇檢測方法的報道較少，如Danks等[20]建立了一種用于定量檢測戊唑醇的競爭性ELISA方法，其最低檢出質(zhì)量濃度為20 ng/mL。侯世澄等[21]利用戊唑醇對牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光淬滅作用，建立熒光光度法檢測戊唑醇，其檢出限為0.66 μg/mL。由于本方法采用的是肉眼判別結果，考慮到采用層析試紙熒光讀數(shù)儀一般可以提高其檢測靈敏度一個數(shù)量級左右[11-12]，因此，本方法與上述的戊唑醇檢測的方法對比，其靈敏度、便攜性和操作簡便性都具有一定的優(yōu)勢。許俊麗等[13]將膠體金探針和樣品溶液在微孔孵育一段時間后，建立基于濕法膠體金免疫層析的戊唑醇檢測方法，對戊唑醇檢測靈敏度達到6.25 ng/mL。盡管本研究中的方法靈敏度低于上述方法，但是本方法基于干法檢測，只需要一步操作，且無需儀器讀取，因此更能體現(xiàn)試紙操作簡單、成本低和靈敏度高等優(yōu)點。

圖10 試紙條檢測對戊唑醇的靈敏度Fig.10 Sensitivity of detecting tebuconazole

2.4 特異性分析實驗

分別選用10 μg/mL的丙環(huán)唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇三唑類殺菌劑和1 μg/mL的戊唑醇作為可能存在的農(nóng)藥殘留共存物進行特異性實驗。如圖11所示，10 μg/mL的丙環(huán)唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇并沒有引起T線上信號的響應，這說明本方法對于戊唑醇的檢測具有良好的特異性。

圖11 試紙條檢測戊唑醇的特異性Fig.11 Specificity of tebuconazole test strip

2.5 實際樣品中的檢測

根據(jù)許俊麗等[13]對果蔬的預處理操作，將黃瓜用食品粉碎機打碎成泥漿狀，然后取10 g樣品于50 mL離心管中，然后在渦旋儀上振蕩15 min，并分別加入10 mL乙腈和1~3 g NaCl，振蕩混勻30 min，隨后在5 000 r/min條件下離心5 min使樣品殘渣、水相和有機相分層。準確吸取5 mL上層提取液于10 mL離心管中，氮氣吹干，殘留物加入5 mL緩沖液（體積分數(shù)5%甲醇-PBS混合液）復溶后加入戊唑醇標準品使其質(zhì)量濃度分別為0、50、100、500 ng/mL和1 μg/mL用作試紙條檢測，但首先需要去除基質(zhì)干擾效應，如表1所示。將基質(zhì)以兩倍梯度稀釋，結果發(fā)現(xiàn)當稀釋倍數(shù)為16倍時對試紙條結果讀取沒有影響，基于熒光及比色檢測靈敏度分別為100 ng/mL和1 μg/mL，檢測結果表明添加質(zhì)量濃度≥100 ng/mL和≥1 μg/mL時，濃縮提取后用體積分數(shù)5%甲醇-PBS稀釋16倍時，檢測結果可與緩沖液配制標準液一致。上述結果表明，乙腈提取黃瓜樣品時基質(zhì)存在較明顯干擾，但是通過緩沖液適當稀釋既可以消除樣品基質(zhì)對上述試紙條檢測戊唑醇的干擾。上述試紙條的熒光檢測模式，對黃瓜中戊唑醇的定性檢測限為0.8 mg/kg。我國對黃瓜中戊唑醇的殘留限量為1.0 mg/kg，因此，本研究中的試紙條可以滿足監(jiān)管的要求。

表1 黃瓜中戊唑醇的檢測Table 1 Detection of tebuconazole（TEB）in cucumber

3 結語

本研究中基于Au@PDA抗體復合物以及半導體量子點，成功構建了一種裸眼比色和熒光雙信號檢測戊唑醇試紙條。通過對檢測條件的優(yōu)化，在熒光檢測模式下，其檢測靈敏度比比色檢測模式提高了10倍，和其他檢測方法相比本研究的方法操作過程簡單、檢測速度快，從而實現(xiàn)了對戊唑醇的高靈敏定性分析。