曹 寧， 申炳陽(yáng)， 喻梓瑄， 占太杰， 周新麗

（上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

由食源性致病菌引起的食源性疾病不僅嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，還會(huì)導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]，如何快速、準(zhǔn)確地識(shí)別食源性致病菌顯得尤為重要[3-4]。常用的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)是分子診斷技術(shù)[5]，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）。核酸提取是分子診斷的第一步，核酸的提取質(zhì)量與效率直接影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和診斷結(jié)果[6-7]。目前，基于磁珠法提取核酸的方法最為常見(jiàn)，采用特異性磁珠能夠捕獲樣品中的靶標(biāo)核酸，通過(guò)外部磁體的移動(dòng)執(zhí)行多步驟洗滌，但該方法提取核酸存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作煩瑣、試劑損耗多等缺點(diǎn)，極大降低了檢測(cè)效率。

微流控技術(shù)是在微觀尺寸下控制、操作和檢測(cè)復(fù)雜流體的技術(shù)，通道和反應(yīng)腔尺寸為微米級(jí)，具有小型化和集成化的特點(diǎn)[8-9]。目前，微流控技術(shù)能夠把化學(xué)和生物等多領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、分離、等分、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)等操作集成在芯片上[10-11]，且多單元靈活組成，構(gòu)成芯片實(shí)驗(yàn)室。將微流控技術(shù)用于磁珠法提取核酸[12-13]，能夠減少擴(kuò)散距離、縮短提取時(shí)間、簡(jiǎn)化操作步驟，該方法已成功應(yīng)用于RNA[14-15]和DNA[16]的純化，以及細(xì)胞分離[17]和免疫測(cè)定[18]。Shi等[19]提出了一種磁珠法與微流控技術(shù)相結(jié)合的方法用于核酸提取。該系統(tǒng)使用親水性斑點(diǎn)固定微流控液滴，通過(guò)磁體控制磁珠在液滴之間運(yùn)動(dòng)。這種方法可以在低濃度的培養(yǎng)基中提取總RNA，提取的樣品量滿足實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)，提取過(guò)程耗時(shí)5 min。此方法能同時(shí)提取多個(gè)樣品，還可以從復(fù)雜樣品中提取微量核酸，但不能測(cè)量核酸提取濃度、優(yōu)化反應(yīng)條件。Shu等[20]提出了一種自動(dòng)液滴陣列方法，首先將試劑以油包水形式進(jìn)行預(yù)存儲(chǔ)，油相能夠通過(guò)交互作用滲入微孔和縫隙，而水相被表面張力排除在外；其次，通過(guò)自動(dòng)液滴陣列控制磁珠的運(yùn)動(dòng)來(lái)完成樣品的裂解、洗滌、洗脫和檢測(cè)。此方法需要編程方式來(lái)自動(dòng)化控制磁珠，可操作性較差。Suimpf等[21]提出了一種在離心微流控芯片上對(duì)甲型H3N2流感病毒進(jìn)行全自動(dòng)樣品檢測(cè)方法，該檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)離心微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)基于PCR的病原體檢測(cè)自動(dòng)化，將所有必要過(guò)程集成在一張芯片上。此方法從樣品到檢測(cè)完成的全部分析時(shí)間不到3.5 h，但該芯片設(shè)計(jì)復(fù)雜，制造難度大，成本高，不易進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。

針對(duì)上述問(wèn)題，作者設(shè)計(jì)并制作了一種用磁珠法提取核酸的微流控芯片，該芯片具有制作簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單、試劑消耗量低、核酸提取環(huán)境封閉性好等優(yōu)勢(shì)，并可對(duì)3種常見(jiàn)食源性致病菌進(jìn)行核酸提取。為了提高核酸提取效率，對(duì)芯片通道的親水處理時(shí)間，核酸提取孵育時(shí)間、磁珠混合次數(shù)及洗脫時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate，PMMA；光學(xué)級(jí)）：日本三菱科技有限公司產(chǎn)品；雙面膠（光學(xué)級(jí)）：東莞富印膠粘科技有限公司產(chǎn)品；NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司產(chǎn)品；DP705磁珠提取試劑盒：天根生化科技有限公司產(chǎn)品；B600001 Taq DNA聚合酶：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株大腸桿菌（ATCC43895）、沙門(mén)氏菌（IQCC10518）、單增李斯特氏菌（ATCC19117）：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫所贈(zèng)送。

1.1.3 引物采用Primer premier 5.0分別以rfbe、sefA、hlyA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和單增李斯特氏菌PCR引物設(shè)計(jì)。大腸桿菌上游引物rfbe-F：AAGATTGCGCTGAAGCCTTTG，下 游 引 物rfbe-R：CATTGGCATCGTCTGGACAG。沙門(mén)氏菌上游引物sefA-F：TTTACGGTCTATTTTGATTTG，下游引物sefA-R：ATATGCTCCACAAGGTTAATG。單增李斯特氏菌上游引物hlyA-F：CTGGCACGGACTTC CACTTAC，下游引物hlyA-R：TTTGAGCACCGATG ATGATTT。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

VLS2.30二氧化碳激光雕刻機(jī)：美國(guó)UNIVERSAL公司產(chǎn)品；TBK508芯片貼合機(jī)：深圳深旺達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；YQ-620C超聲波清洗機(jī)；上海易凈超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；DW-86L828超低溫保存箱：青島海爾科技有限公司產(chǎn)品；HD850超凈臺(tái)：江蘇杰森博生物科技有限公司產(chǎn)品；GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；NANO DROP 2000C超微量分光光度計(jì)、ST16低溫離心機(jī)：北京賽默飛科技有限公司產(chǎn)品；ZQZY-70BF搖床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 芯片的設(shè)計(jì)與制作

采用磁珠法提取食源性致病菌中的核酸。磁珠法提取原理為[22]：用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。100 nm~1 μm的磁珠可以有效吸附生物樣品中微量核酸，再通過(guò)外界磁場(chǎng)將磁珠吸附、轉(zhuǎn)移、洗滌、洗脫等，完成核酸的純化。根據(jù)此原理，微流控芯片主要包括1個(gè)核酸裂解腔、4個(gè)核酸清洗腔及1個(gè)核酸洗脫腔，分別用于磁珠與核酸的結(jié)合、核酸純化及核酸的洗脫。

采用三維設(shè)計(jì)軟件Solidworks設(shè)計(jì)出芯片的數(shù)字模型，使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制作，芯片的尺寸為70 mm×60 mm×1.8 mm。如圖1所示，芯片由3層厚度分別為0.5、0.8、0.5 mm的PMMA組成，上層主要包括氣動(dòng)閥（A1~A5）、抽氣孔（B1）及通氣孔（C1）；中層主要包括裂解腔（L1）、清 洗腔（P1~P4）、洗脫腔（E1）、毛細(xì)管閥（M）等結(jié)構(gòu)，各腔室的體積分別為156、180、100、180、60、15 μL。最終，使用底板進(jìn)行密封鍵合，形成一個(gè)平行且互相可貫通的微流體網(wǎng)絡(luò)。采用抽氣孔（B1）負(fù)壓抽取的方式使流體按照通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行流動(dòng)。芯片使用激光雕刻機(jī)進(jìn)行制作，采取光學(xué)級(jí)雙面膠黏合的方式進(jìn)行封裝，使用芯片貼合機(jī)進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)鍵合并除去氣泡，最終制作出核酸提取微流控芯片。

圖1 核酸提取芯片的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of nucleic acid extraction chip

1.4 芯片上核酸提取程序

首先，分別將磁珠、清洗液1、清洗液2、清洗液3、清洗液4及洗脫液預(yù)存儲(chǔ)于L1、P1～P4以及E1中，使用硅膠貼進(jìn)行密封。其次，將食源性致病菌的裂解液加入裂解腔中進(jìn)行孵育裂解，裂解液中含有溶菌酶及蛋白酶K，溶菌酶能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁，而蛋白酶K促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，當(dāng)DNA從食源性致病菌中釋放后，磁珠會(huì)將其吸附。在裂解過(guò)程中，使用釹鐵硼（NdFeB）磁鐵手動(dòng)控制磁珠的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)菌裂解和DNA吸附過(guò)程。裂解完成后，吸附有DNA的磁珠被磁鐵牢牢固定在裂解腔內(nèi)，此時(shí)注射泵以10 μL/s的流量進(jìn)行液體負(fù)壓抽取去除裂解液。然后，按照A1~A4的先后順序依次打開(kāi)氣動(dòng)閥，使P1、P2、P3、P4中的清洗液分次清洗帶有核酸的磁珠，進(jìn)而去除磁珠上非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，完成核酸的純化過(guò)程。在洗脫前，要確保清洗液中的乙醇完全揮發(fā)，以10 μL/s的流量進(jìn)行液體負(fù)壓抽取，干燥10 min，去除磁珠周?chē)靶酒系臍埩粢后w。最后，打開(kāi)氣動(dòng)閥（A5）將洗脫液釋放到裂解腔，在56℃的恒溫下進(jìn)行磁珠上的核酸洗脫。將純化后的核酸移至離心管中，用于后續(xù)檢測(cè)或放入-20℃進(jìn)行保存。

1.5 通道的親水處理時(shí)間對(duì)核酸提取的影響

PMMA為芯片制作材料，具有優(yōu)異的光學(xué)性能，但是其表面的疏水性能不利于微通道中流體的流動(dòng)。為了減少流動(dòng)時(shí)氣泡的產(chǎn)生、降低溶液的損耗、提高核酸的提取質(zhì)量濃度，采用吐溫20對(duì)PMMA表面進(jìn)行親水處理[23]。將芯片PMMA放入體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20溶液中，分別靜止放置5、10、15、20、25、30 min，再將PMMA取出，放入烘箱30 min烘干。滴加體積為5 μL的去離子水于處理后的PMMA表面，測(cè)定水珠在芯片上接觸角的大小，以此來(lái)判斷親水性的強(qiáng)弱。最后，使用吐溫20試劑處理前和處理后的芯片進(jìn)行大腸桿菌核酸提取，分析親水處理對(duì)核酸提取質(zhì)量濃度的影響。

1.6 芯片上核酸提取條件的優(yōu)化

為了提高芯片上核酸提取質(zhì)量濃度及純度，采用上述芯片對(duì)大腸桿菌進(jìn)行核酸提取，分析孵育時(shí)間、磁珠混合次數(shù)及洗脫時(shí)間對(duì)核酸提取效果的影響。

核酸孵育過(guò)程中，通過(guò)增加孵育時(shí)間，磁珠上的結(jié)合位點(diǎn)能夠與核酸充分結(jié)合。選取孵育時(shí)間分別為3、6、9、12、15 min，每3 min進(jìn)行一次磁珠的三維旋轉(zhuǎn)，其他條件保持不變，最終在56℃的恒溫加熱板上加熱10 min提取核酸，測(cè)定不同孵育時(shí)間條件下提取核酸的質(zhì)量濃度。

核酸孵育過(guò)程中，通過(guò)三維旋轉(zhuǎn)磁鐵來(lái)進(jìn)行磁珠混合，增強(qiáng)磁珠捕獲效果，該過(guò)程核酸與捕獲探針結(jié)合來(lái)捕獲具有匹配序列的靶標(biāo)，每隔3 min將磁鐵三維旋轉(zhuǎn)3、5、7、9、11次，其他條件保持不變，最終在56℃的恒溫加熱板上加熱10 min提取核酸，測(cè)定不同磁珠混合次數(shù)條件下提取核酸的質(zhì)量濃度。

核酸洗脫過(guò)程中，通過(guò)洗脫液及高溫使磁珠與核酸連接間的共價(jià)鍵斷裂，核酸轉(zhuǎn)移至洗脫液。選取洗脫時(shí)間為5、10、15、20、25 min，并將芯片放在56℃的加熱板上，其他條件保持不變，測(cè)定不同洗脫時(shí)間條件下提取核酸的質(zhì)量濃度。

1.7 核酸質(zhì)量濃度測(cè)定

提取核酸的質(zhì)量濃度通過(guò)超微量分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。將洗脫液的測(cè)試結(jié)果作為空白對(duì)照，得到DNA質(zhì)量濃度及DNA純度（A260/A280）。DNA質(zhì)量濃度越高，表明相同菌株濃度下的DNA提取率最高；DNA純度（A260/A280）取值在1.8~2.0表明純度很好，取值小于1.8表明有蛋白質(zhì)污染，取值大于2.0表明DNA有部分降解或有RNA污染[24]。

1.8 芯片提取核酸的擴(kuò)增與驗(yàn)證

用微流控核酸提取芯片對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門(mén)氏菌）及革蘭氏陽(yáng)性菌（單增李斯特氏菌）進(jìn)行核酸提取，對(duì)芯片上提取的3種不同種類(lèi)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。添加1 μL模版DNA，5 μL 10×PCR Buffer緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8，25℃）），3 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 mmol/L dNTP，2 μL上游和下游引物，1 μL 5 U/μL Taq聚合酶添加至離心管中，用去離子水定容至最終體積為50 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)方案：94℃初始變性5 min，94℃變性45 s，58℃進(jìn)行30 s，72℃進(jìn)行60 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照。添加20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL SinoBio 2×Taq混合液混合，在120 V恒定電壓下，用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，將凝膠置于凝膠成像儀上，在紫外線照射下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 微流控芯片上的流體控制

微流控芯片上的流體控制過(guò)程如圖2所示。在芯片上的L1、P1、P2、P3、P4及E1等區(qū)域分別定量加入156、180、100、180、60、15 μL的染料（見(jiàn)圖2（a）），再使用硅膠貼密封住氣動(dòng)閥（A1~A5）及抽氣孔（見(jiàn)圖2（b））。調(diào)節(jié)注射泵以10 μL/s的流量進(jìn)行液體負(fù)壓抽取，抽取裂解腔中液體（見(jiàn)圖2（c））。抽取完成后，將清洗腔P1的氣動(dòng)閥A1的密封硅膠貼轉(zhuǎn)移至通氣孔，使清洗腔P1內(nèi)氣壓與大氣平衡，注射泵將清洗腔P1的液體泵送至裂解腔進(jìn)行清洗（見(jiàn)圖2（d）），20 s后抽取到注射泵內(nèi)。將清洗腔P2的氣動(dòng)閥A2的密封貼轉(zhuǎn)移至清洗腔P1的氣動(dòng)閥A1處，清洗腔P2的液體由注射泵泵送至裂解腔進(jìn)行清洗（見(jiàn)圖2（e）），10 s后抽取到注射泵內(nèi)。同理，依次將清洗腔P3、清洗腔P4、洗脫腔的液體泵送至裂解腔（見(jiàn)圖2（f）~（h）），完成流體控制的全過(guò)程（見(jiàn)圖2（i））。

圖2 芯片上流體控制實(shí)物圖Fig.2 Images of fluid control on the chip

2.2 通道的親水處理對(duì)核酸提取的影響

2.2.1 吐溫20處理時(shí)間對(duì)通道親水程度的影響接觸角是固、液、氣三相的交界點(diǎn)和固-液界面與液-氣界面的切線形成的夾角，液體在固體表面的接觸角能夠反映液體在固體表面的親疏水性[25-26]。親水性增加，試劑在芯片中的殘留量下降，核酸提取率增加。圖3（a）從左到右依次為未做親水處理、芯片放入體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中分別處理15 min和30 min后液滴在芯片表面的圖像。測(cè)量不同處理時(shí)間下液滴與芯片的接觸角如圖3（b）所示，沒(méi)有經(jīng)過(guò)吐溫20處理的PMMA，其接觸角為65.92°，隨著吐溫20處理時(shí)間的不斷增加，接觸角逐漸變小，當(dāng)處理時(shí)間大于25 min后，接觸角達(dá)到最小且基本保持不變，說(shuō)明親水性能趨于穩(wěn)定，此時(shí)PMMA的親水性最好。

圖3 吐溫20處理時(shí)間與接觸角之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between reagent processing time and contact angle

2.2.2 親水處理對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響芯片親水處理前后，核酸提取質(zhì)量濃度由表1所示，吐溫20處理前芯片上的核酸提取質(zhì)量濃度為80.2 ng/μL，經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20處理30 min后，芯片上核酸提取質(zhì)量濃度為99.40 ng/μL，表明親水處理能夠有效提高核酸提取質(zhì)量濃度?？刹捎皿w積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20對(duì)PMMA處理30 min，作為后續(xù)核酸提取最優(yōu)條件。

表1 芯片親水處理前后的核酸提取質(zhì)量濃度及純度Table 1 Nucleic acid extraction concentration before and after the hydrophilic treatment of the chip

2.3 芯片上核酸提取條件的優(yōu)化

2.3.1 孵育時(shí)間優(yōu)化孵育時(shí)間對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響如圖4所示。從圖中可以看出，隨著孵育時(shí)間的提高，DNA與磁珠吸附效果逐漸增強(qiáng)，在9 min時(shí)達(dá)到最高值，核酸提取質(zhì)量濃度為72.65 ng/μL；孵育時(shí)間大于9 min后，核酸提取質(zhì)量濃度開(kāi)始下降，這是因?yàn)榇胖樯系慕Y(jié)合位點(diǎn)有限，其他非特異性雜質(zhì)與核酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠上的位點(diǎn)，導(dǎo)致核酸提取質(zhì)量濃度下降。從圖4中可以看出，孵育時(shí)間為6、9、12、15 min時(shí)，A260/A280均在1.8~2.0，表明孵育時(shí)間在6~15 min時(shí)，核酸純度良好。綜合考慮，選擇孵育時(shí)間9 min為最佳孵育時(shí)間。

圖4 孵育時(shí)間對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of incubation time on the nucleic acid extraction concentration on the chip

2.3.2 磁珠混合次數(shù)優(yōu)化磁珠混合次數(shù)對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響如圖5所示。從圖中可以看出，隨著磁珠混合次數(shù)的增加，核酸提取質(zhì)量濃度不斷增加，在磁珠混合次數(shù)為9次時(shí)達(dá)到最高值，隨后基本保持不變。在磁珠混合次數(shù)為9次時(shí)，核酸提取質(zhì)量濃度為94.76 ng/μL。在使用磁珠提取核酸的過(guò)程中，磁鐵與磁珠吸附后，磁珠易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，不能充分吸附目標(biāo)核酸，且團(tuán)聚磁珠難以分散，隨著磁珠混合次數(shù)的提高，磁珠團(tuán)聚現(xiàn)象減少。當(dāng)磁珠混合次數(shù)在5、7、9次時(shí)，A260/A280的比值在1.8~2.0，表明核酸純度良好。綜合考慮，選擇磁珠混合次數(shù)9次為最佳磁珠混合次數(shù)。

圖5 磁珠混合次數(shù)對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of magnetic beads mixing times on the nucleic acid extraction concentration on the chip

2.3.3 洗脫時(shí)間優(yōu)化洗脫時(shí)間對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響如圖6所示。從圖中可以看出，隨著洗脫時(shí)間的增加，核酸提取質(zhì)量濃度不斷增加，在洗脫時(shí)間為20 min時(shí)達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始下降。在洗脫時(shí)間為20 min時(shí)，核酸提取質(zhì)量濃度為149.80 ng/μL。隨著洗脫時(shí)間的不斷增加，洗脫液在內(nèi)部可能造成蒸發(fā)的現(xiàn)象，核酸提取的質(zhì)量濃度下降。從圖6中可以看出，洗脫時(shí)間為10、15、20、25 min時(shí)，A260/A280的比值在1.8~2.0，表明洗脫時(shí)間在10~20 min時(shí)，核酸純度良好。綜合考慮，選擇洗脫時(shí)間20 min為最佳洗脫時(shí)間。

圖6 洗脫時(shí)間對(duì)芯片上核酸提取質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of elution time on the nucleic acid extraction concentration on the chip

2.4 芯片上3種食源性致病菌的核酸提取質(zhì)量濃度

在上述孵育時(shí)間為9 min、磁珠混合次數(shù)為9次、洗脫時(shí)間為20 min優(yōu)化條件下，用微流控芯片對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門(mén)氏菌）及革蘭氏陽(yáng)性菌（單增李斯特氏菌）進(jìn)行核酸提取，表2為3種食源性致病菌的核酸提取質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，3種食源性致病菌的核酸提取質(zhì)量濃度及純度良好。

表2 3種食源性致病菌的提取質(zhì)量濃度Table 2 Extraction efficiency of three food-borne pathogens

從芯片上收集的DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。圖7為注入2 μL的DNA提取液的凝膠電泳結(jié)果，泳道1、2、3、4分別為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組、大腸桿菌的497 bp擴(kuò)增子、單增李斯特氏菌116 bp擴(kuò)增子及沙門(mén)氏菌443 bp的擴(kuò)增子，證明了芯片上提取出的核酸滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖7 3種食源性致病菌DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增的電泳圖Fig.7 PCR electrophoresis diagrams of three food-borne pathogens

2.5 芯片與其他核酸提取方法對(duì)比

將一些商品化的核酸提取方法與本文中提出的微流控芯片方法進(jìn)行對(duì)比。苯酚氯仿抽提法使用了苯酚、氯仿等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的試劑，核酸提取成本低，但此方法毒性較大，且核酸的回收率較低。由于需要實(shí)驗(yàn)人員的操作，重復(fù)性較差，損失量較大，很難進(jìn)行微量化操作。離心柱法比傳統(tǒng)的苯酚氯仿抽提法提取率高，且能進(jìn)行微量操作，但此方法需要進(jìn)行反復(fù)離心，不便用于高通量、自動(dòng)化的操作及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。磁珠法能夠配合96孔板核酸自動(dòng)提取儀使用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量操作，且操作簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒，但需要精密儀器，不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。當(dāng)微流控法與磁珠法相結(jié)合能夠更加精準(zhǔn)操控磁珠，通過(guò)在芯片上設(shè)計(jì)多個(gè)通道，實(shí)現(xiàn)各個(gè)反應(yīng)單元相互隔離、互不干擾，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)且試劑消耗量低、樣品用量少。

3 結(jié)語(yǔ)

本文中設(shè)計(jì)了一種提取食源性致病菌核酸的微流控芯片，并通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)行親水處理、核酸提取孵育時(shí)間、磁珠混合次數(shù)及洗脫時(shí)間等條件的優(yōu)化，提高了核酸提取效率。此方法與手動(dòng)磁珠提取法相比，核酸捕獲、洗滌、釋放均在芯片上進(jìn)行，磁珠在裂解腔中固定，通過(guò)液體分批次釋放流動(dòng)到裂解腔，避免了微通道閥門(mén)中磁珠的捕獲和丟失及阻塞微通道的問(wèn)題，降低了試劑消耗量。通過(guò)調(diào)節(jié)磁珠與靶標(biāo)序列的結(jié)合時(shí)間（核酸提取時(shí)間）及三維旋轉(zhuǎn)磁鐵的次數(shù)（磁珠混合次數(shù)），提高了目標(biāo)序列的捕獲速率和濃度，減少了在雜交過(guò)程中出現(xiàn)成簇和沉淀的情況，增加靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，提高DNA提取量。此外，基于文中核酸提取的微流控芯片，還能夠增加核酸擴(kuò)增的模塊，為今后集成式核酸提取及擴(kuò)增的一體化芯片制備做準(zhǔn)備。然而，對(duì)食源性致病菌進(jìn)行核酸提取的微流控芯片也存在需要改進(jìn)之處，如流體控制由泵驅(qū)動(dòng)及磁鐵旋轉(zhuǎn)控制由手動(dòng)操控，自動(dòng)化程度還不夠高，處理時(shí)間較傳統(tǒng)核酸提取方法沒(méi)有顯著提高。下一步期望研制出小型一體化商用檢測(cè)設(shè)備，將驅(qū)動(dòng)、旋轉(zhuǎn)、擴(kuò)增檢測(cè)等單元集成于一張芯片，使核酸檢測(cè)人員不需要專(zhuān)業(yè)儀器培訓(xùn)即可在現(xiàn)場(chǎng)及資源不足的條件下進(jìn)行精準(zhǔn)病原體檢測(cè)。