吳倩 鄭秀花 劉亞麗

(1河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院內(nèi)科教研室，河南 安陽 455000；2平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

哮喘是一種高度流行的慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重危害人類健康，由于哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前的治療只能控制癥狀〔1,2〕。進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制并尋求更有效的治療方法是目前研究的熱點(diǎn)。氣道炎癥反應(yīng)是哮喘的重要病理特征，并且是不可逆氣流阻塞的病理基礎(chǔ)〔3,4〕。氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)的炎癥和肥大導(dǎo)致的氣道平滑肌質(zhì)量增加在哮喘氣道高反應(yīng)性和重塑的病理生理中起重要作用。Toll樣受體(TLR)3可識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌病原體的配體，一旦識(shí)別出特定的致病性配體，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)就會(huì)被幾個(gè)銜接分子激活〔5〕。含Toll樣/白細(xì)胞介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域的β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)是髓樣分化因子(MyD)88獨(dú)立反應(yīng)的銜接分子〔6,7〕。TLR3是病毒合成產(chǎn)生的雙鏈RNA的受體，并且TLR3激活會(huì)導(dǎo)致以干擾素產(chǎn)生為特征的抗病毒反應(yīng)及核因子(NF)-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔8〕。人參皂苷Rb1是一種固醇類化合物主要存在于人參屬藥材中，被廣泛用于腦血管病、冠心病的治療〔9,10〕，但其在哮喘疾病中的效果尚未有研究。本研究擬探討人參皂苷Rb1介導(dǎo)TLR3/TRIF信號(hào)通路對(duì)哮喘大鼠模型的抗炎作用機(jī)制，為哮喘的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體重190～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0013，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(渝)2018-0017，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2020031607，將大鼠圈養(yǎng)在溫度為20～25℃，相對(duì)濕度為50%～70%的無病原籠中，自由飲食、飲水。

1.2主要試劑及儀器 人參皂苷Rb1(原料藥，純度99%，河南萊爾茵生物科技有限公司，批號(hào)SAS20191013)；地塞米松(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格0.75 mg/片，批號(hào)20191217)；卵白蛋白、氫氧化鋁凝膠(美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)L10114、L10274)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號(hào)15596-026、10296-010)；SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號(hào)SJ6038-5)；放射免疫沉淀分析緩沖液、聚偏二氟乙烯膜、TBST緩沖液(上海羽朵生物科技有限公司，批號(hào)DF2014、DF2039、DF3604)；羊抗鼠TLR3、TRIF、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Abcam公司，批號(hào)ab65498、ab25418、ab10013)；辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A0192、DS2011)；全自動(dòng)血液分析儀(日本希森美康公司，型號(hào)XS-500i)；血?dú)夥治鰞x(德國西門子公司，型號(hào)Rapidlab 800)；顯微鏡(北京京昊永成商貿(mào)有限公司，型號(hào)JS-750T)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司，型號(hào)7300Plus)；凝膠成像儀(上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)ZF-388)。

1.3動(dòng)物分組、造模及給藥 將大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分成5組：對(duì)照組、模型組、地塞米松組(1 mg/kg)〔11〕、人參皂苷Rb1低劑量組(100 mg/kg)、人參皂苷Rb1高劑量組(200 mg/kg)〔12〕，每組16只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠分別于第1天和第8天腹腔注射氫氧化鋁凝膠(20 mg)和10%卵白蛋白(20 μg)溶液0.2 ml，第15天起開始每天霧化吸入2%的卵白蛋白溶液30 min誘發(fā)哮喘，每天1次，持續(xù)14 d，當(dāng)大鼠出現(xiàn)前肢撓鼻、嗆咳、呼吸加快、呼吸幅度加大、腹肌抽搐、行動(dòng)遲緩等表示激發(fā)成功〔13〕。對(duì)照組大鼠第1天和第8天腹腔注射0.2 ml生理鹽水，第15天起每天霧化吸入生理鹽水。從第15天開始，每日霧化后，地塞米松組大鼠灌胃1 mg/kg的地塞米松，人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠分別灌胃100 mg/kg、200 mg/kg的人參皂苷Rb1，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，灌胃體積均為10 ml/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.4淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、肺/體比值水平測(cè)定 末次給藥后24 h處死大鼠，收集大鼠腹主動(dòng)脈血液樣品，采用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平；使用血?dú)夥治鰞x測(cè)定血液樣品中PaO2水平；獲取大鼠完整雙肺組織，稱量肺濕重，計(jì)算肺/體比值，肺/體比值=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)×100%。

1.5大鼠肺組織病理學(xué)觀察 取大鼠右肺部分肺組織制成石蠟切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平 將部分肺組織勻漿化，Trizol試劑提取肺組織中總RNA，采用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix試劑進(jìn)行定量PCR。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下：TLR3正向5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3′，TLR3反向5′-GCCTTCCTCCACCATTACCAACAATGA-3′；TRIF正向5′-ATGATGAGCAGCATTGTACAGG-3′；TRIF反向5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCGTAC-3′；β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′，β-actin反向5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。PCR循環(huán)條件如下：95℃持續(xù)5 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95℃ 30 s、60℃20 s、72℃ 20 s)。反應(yīng)體系：正向引物1 μl、反向引物1 μl、cDNA 2 μl、SYBR Green qPCR Mix 3 μl、雙蒸水(ddH2O)8 μl。使用β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-ΔΔCt法計(jì)算TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平。

1.7蛋白免疫印跡法測(cè)定大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平 將部分肺組織勻漿化，使用放射免疫沉淀分析緩沖液從肺組織中提取總蛋白，蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h，在TBST緩沖液中洗滌3次，然后與TLR3(1∶1 000)、TRIF(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗在4℃孵育過夜，將膜與二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h，采用ECL試劑盒顯色，在凝膠成像儀中觀察蛋白條帶并拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺/體比值、PaO2水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺/體比值明顯升高，PaO2水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺/體比值顯著降低，PaO2水平顯著升高(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺/體比值顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組，PaO2水平顯著高于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺/體比值顯著升高，PaO2水平顯著降低(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺/體比值、PaO2水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肺/體比值、PaO2水平比較

2.2各組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組大鼠肺組織HE染色比較 對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)無異常；模型組氣道異常狹窄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，平滑肌增厚明顯；地塞米松組、人參皂苷Rb1高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，氣道上皮細(xì)胞增生明顯減輕，管腔大小正常，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；人參皂苷Rb1低劑量組管腔狹窄，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.4各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血液淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平及肺組織中TLR3、TRIF mRNA比較

2.5各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

1～5：對(duì)照組，模型組，地塞米松組，人參皂苷Rb1低劑量組，人參皂苷Rb1高劑量組圖2 各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

哮喘是全球常見的炎性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是氣道炎癥、氣道壁重塑和氣道高反應(yīng)性〔14〕。氣道炎癥是氣道壁重塑和氣道高反應(yīng)性的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)〔15〕，人參皂苷Rb1以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和人ASMC的增殖、炎癥反應(yīng)，從而防止氣道重塑的發(fā)生。人參皂苷Rb1還可顯著下調(diào)哮喘大鼠模型中Ca2+通道蛋白的活性，對(duì)哮喘發(fā)揮預(yù)防和治療作用〔16〕。本研究結(jié)果說明人參皂苷Rb1減輕了哮喘模型大鼠肺部炎癥反應(yīng)，且人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松具有相似的效果。

TLR在髓樣和非髓樣細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞)上均表達(dá)。ASMC細(xì)胞位于氣道外表，除了提供物理屏障功能外，它們還通過促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽介導(dǎo)對(duì)微生物產(chǎn)物的免疫反應(yīng)。此外，ASMC表達(dá)幾種TLR，并且可以在體外對(duì)TLR2、TLR3和TLR5激動(dòng)劑作出反應(yīng)〔17〕。研究表明，TLR3在ASMC中表達(dá)，并可以通過MyD88銜接分子介導(dǎo)氣道炎癥。TRIF是TLR3的下游因子，存在于哺乳動(dòng)物呼吸系統(tǒng)的各個(gè)部分，包括氣管感覺神經(jīng)、ASMC、上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、黏膜下腺和炎性細(xì)胞。研究表明，TRIF在咳嗽反射中起著至關(guān)重要的作用〔18〕。當(dāng)TRIF被激活時(shí)，它誘導(dǎo)Ca2+流入神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致膜去極化達(dá)到閾值電位，進(jìn)而導(dǎo)致支氣管收縮、黏液分泌和咳嗽反射。此外，TRIF通道激活引起的Ca2+流入可能觸發(fā)速激肽(TK)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的釋放，導(dǎo)致支氣管收縮，氣管黏膜水腫和炎癥細(xì)胞趨化因子生成。TRIF通道與哮喘高度相關(guān)，因?yàn)門RIF通道的遺傳決定因素的水平和活性影響哮喘的發(fā)生病理生理過程。缺氧顯著增加人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中TRIF mRNA和蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致胞質(zhì)Ca2+濃度增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖〔19,20〕。本研究結(jié)果說明人參皂苷Rb1減輕哮喘大鼠肺部炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能與其抑制肺組織中TLR3、TRIF mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，人參皂苷Rb1可降低哮喘模型大鼠肺部炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與人參皂苷Rb1抑制哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制TLR3/TRIF信號(hào)通路的激活有關(guān)。