衡立，張立國，董婧婷，李治國，曹鳳宏*

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是老年男性最常見的惡性腫瘤之一，也是男性癌癥患者的第二大死因［1］。對于晚期PCa患者，雄激素剝奪治療（androgen-deprivation therapy，ADT）仍然是標準方法，主要通過手術或藥物減少雄激素產生或干擾雄激素受體（androgen receptor，AR）功能。但大多數患者在ADT后2～3年內發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），且中位生存期14（9，30）個月；此外，CRPC患者的疾病進展風險較高，15%～33%的患者在2年內發(fā)生轉移，進一步增加了這一人群的死亡負擔［2］。

去勢治療雖可以降低PCa患者體內雄激素水平，但多數患者在術后仍然需接受抗雄激素藥物治療，提示AR信號通路在PCa復發(fā)以及向CRPC演進中發(fā)揮了重要作用。目前研究發(fā)現，在接受ADT后的患者中AR信號通路主要通過AR過表達、雄激素局部合成、AR剪切變異體以及生長因子和細胞因子激活AR等方式被重新激活［3］。

PCa患者經過ADT后，體內會產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH-）等，破壞與抗氧化物酶之間的平衡，加重氧化應激。由于H2O2能夠通過氧化催化區(qū)域的半胱氨酸殘基抑制酪氨酸磷酸酶，激活酪氨酸激酶和下游信號傳導，因此有學者認為H2O2可以充當第二信使，調控AR信號通路［4］。本文將關于氧化應激調節(jié)AR信號傳遞分子機制的相關研究進行綜述，對PCa臨床治療有一定意義。

1 CRPC演進中AR信號通路發(fā)揮重要作用

前列腺作為雄激素依賴性器官，生長發(fā)育與AR信號通路密不可分。當AR與雄激素結合后引起AR構象改變，從熱休克蛋白復合體中解離并移動到前列腺間質和腺上皮細胞核中形成二聚體，與核受體結合介導多種生物學活性，調控前列腺上皮細胞的分泌、生長、增生和凋亡。PCa的生長和演進也離不開AR信號，已有研究提示，在80%的CRPC患者中AR信號通路通過多種方式被重新激活，調節(jié)靶基因轉錄和PCa細胞生長［3］。首先，AR與靶細胞核中特定的DNA序列結合即雄激素應答元件，招募不同的共同激活復合物，例如類固醇受體共激活子、p300/CBP相關因子、AR輔助因子等，打開染色質結構以促進轉錄。其次，AR通過與其他轉錄因子結合并向靶基因招募額外的輔激活因子來調控轉錄，或者招募一些輔阻遏物與雄激素應答元件結合抑制轉錄。最后，除了經典的AR信號，AR還可以啟動核外信號，通過配體非依賴的方式被激活［5］。見圖1。

圖1 前列腺癌細胞中AR信號分子機制Figure 1 Diagram of AR signaling molecular mechanism in prostate cancer cells

2 去勢治療誘導PCa細胞氧化應激增加

正常生理水平的雄激素能夠維持前列腺中ROS與抗氧化物酶、細胞凋亡與增殖之間的平衡［6］。ADT通過阻斷AR信號，破壞正常雄激素狀態(tài)，并提高了體內3種還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的mRNA水平，例如Nox1、Nox2（gp91phox）和Nox4，同時也降低抗氧化物酶的表達水平，例如錳超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白1、谷胱甘肽過氧化物酶1等，導致ROS產生過量，加重氧化應激［7］。

3 氧化應激參與AR信號通路重激活促進CRPC演進

3.1 氧化應激介導轉錄因子誘導AR過表達 AR過表達是基因擴增的結果，與許多轉錄因子的表達增加密切相關，如Twist1、Y-box結合蛋白-1（YB-1）、核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和cAMP應答元件結合蛋白（CREB）等，這些轉錄因子與AR基因啟動子結合促進AR轉錄。H2O2通過調節(jié)Twist1二聚體向Twist1-E2a異二聚體轉變誘導Twist1反式激活與表達，并與AR啟動子區(qū)域的E-box序列（CANNTG）結合影響AR轉錄［8］，見圖2。在體外實驗中，當PCa細胞系LNCaP細胞暴露于H2O2后會誘導Twist1表達，AR的表達也逐漸上升；然而，當LNCaP細胞暴露于H2O2和自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）中后，過氧化氫被完全清除，Twist1和AR基因表達也隨之降低；使用Twist1特異性siRNAs沉默Twist1可以降低AR表達；這些結果提示為響應PCa細胞中的氧化應激，Twist1正調控AR表達［9-10］。另外，YB-1也是一種應激相關蛋白，H2O2通過激活蛋白激酶B（PKB）/絲蘇氨酸蛋白激酶（Akt）或核糖體蛋白S6激酶使YB-1在Ser102處磷酸化［11］，見圖2。磷酸化的YB-1核易位后與AR啟動子Y-box結合，激活和調控AR轉錄；YB-1還可以調節(jié)AR-V7的表達，促進CRPC進展［12］；YB-1也是Twist1的主要靶基因，在翻譯水平影響Twist1表達，因此Twist1和YB-1之間的相互調節(jié)能夠共同促進AR轉錄［13］，見圖2。

雄激素和NF-κB信號通路之間的相互作用可以改變AR轉錄活性，重新編碼PCa細胞的轉錄組，從而影響PCa向CRPC的轉化［14］。NF-κB二聚體在細胞質中與核因子-κB抑制蛋白（IκB）形成復合物被隔離，H2O2通過蛋白激酶D（PKD）激活IκB激酶（IKK）復合物，IKK激活后使NF-κB與IκB解離并向細胞核易位，在此過程中H2O2通過Src介導的兩條信號通路激活PKD?；罨腟rc首先通過Abl誘導PKD在PH（pleckstrin homology）結構域Y463處磷酸化，使PH結構域暴露；其次，在PKD的催化結構域和活化環(huán)殘基S738/S742上被PKCδ第二次磷酸化，導致PKD完全激活。IKK被PKD激活后導致IκBα蛋白在Ser32和Ser36處磷酸化，隨后被降解，NF-κB二聚體從復合物中解離并易位到細胞核［15］，見圖2。NF-κB進入細胞核后直接與AR啟動子和增強子結合，調節(jié)AR的表達和功能，并提高血清前列腺特異性抗原（PSA）水平以及細胞增殖水平［16］。NF-κB還可以促進剪接因子核內不均一核糖核蛋白A1（hnRNPA1）生成，誘導AR產生剪接變異體，如AR-V7對ADT產生抗性［17］。除了直接調節(jié)AR外，NF-κB還可以通過促進Twist1的表達間接影響AR轉錄活性。由ROS介導的其他腫瘤相關信號通路中，NF-κB作為許多信號下游底物中的重要底物在前列腺腫瘤的增殖中發(fā)揮重要作用，例如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、PKB和蛋白激酶C（PKC）［18-19］。因此，ADT的同時阻斷NF-κB信號可能是降低CRPC細胞生長的有效策略。

CREB是一種與cAMP反應元件（CRE）結合的轉錄因子，參與調控AR的轉錄。ROS氧化蛋白激酶A（PKA）Ⅰ型調節(jié)亞基的Cys17和Cys38，使PKA亞基間形成二硫鍵，導致全酶復合物解離并激活［20］，見圖2。CREB被PKA磷酸化后與AR基因啟動子區(qū)的cAMP反應元件結合，調控AR轉錄。此外，去勢治療通過抑制超氧化物歧化酶2的表達，以依賴ROS的方式調控5種核受體共調節(jié)因子的表達，包括核受體共激活因子4（NCOA4），并通過改變共調節(jié)因子之間的平衡誘導AR 重新激活［21］。

氧化應激還可以通過腫瘤信號通路激活與AR表達相關的轉錄因子。在PI3K/Akt信號通路中，ROS通過抑制同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）來提高PI3K/Akt信號的活性［22］。首先，H2O2介導PTEN上的半胱氨酸殘基Cys-124和Cys-71之間形成二硫鍵使PTEN失去活性，從而增強其穩(wěn)定性并阻止其向膜募集，見圖2。其次，H2O2還可以誘導PTEN的翻譯后修飾，例如S-亞硝基化（SNO），其有助于增強泛素蛋白酶體功能，導致PTEN失活和降解。PTEN的失活不僅減輕了對Akt信號通路的抑制，而且也使抑制PCa細胞增殖的NKX3.1基因表達明顯降低［23］。Akt被氧化應激激活后熱休克蛋白27活性也隨之增強，不僅可以防止AR降解，且可通過十六烷?；揎桝R，促進AR核定位［24-25］，見圖2。叉頭框蛋白O亞族3a（FOXO3a）作為Akt下游的靶基因，與AR啟動子區(qū)域的FOXO反應元件結合促進AR轉錄，可以推動CRPC的演進［26］。在MAPK信號通路中，凋亡信號調節(jié)激酶（apoptosissignal regulatingkinase 1，ASK1）是上游MAPKKK中的一種，使MKK4、MKK3和MKK6磷酸化并調節(jié)JNK和p38MAPK通路。ASK1以硫氧還蛋白（TRX）-ASK復合物的形式被ROS激活［27］。TRX是一種氧化還原調節(jié)蛋白，具有感應ROS水平和維持細胞內氧化還原狀態(tài)以及調節(jié)ASK1活性的作用。在休眠細胞中，還原形式的TRX與ASK1的N端結構域結合，并通過其N端螺旋結構域干擾活性同源寡聚體的形成，從而使ASK1保持非活性狀態(tài)。H2O2產生后，TRX轉變成氧化形式并從ASK1中解離，觸發(fā)ASK1自磷酸化且獲得激酶活性［28］，見圖2。JNK信號通路被激活后觸發(fā)了下游靶基因的轉錄，如甾醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP），見圖2。在LNCaP細胞中SREBP-1可以與AR啟動子結合影響AR轉錄促進PCa細胞增殖，同時通過誘導Nox5表達，提高ROS水平［29］。

3.2 氧化應激介導瘤內局部雄激素水平升高 研究表明，接受ADT后的CRPC患者瘤內局部雄激素水平與未接受激素治療的患者相似。雖然目前沒有直接證據表明氧化應激可促進PCa的雄激素合成，但一些研究提示氧化應激與類固醇生成之間存在關系。如前所述，氧化應激通過PI3K/Akt信號通路激活下游SREBP基因，促進脂質合成酶的表達，如脂肪酸合酶、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶和低密度脂蛋白膽固醇受體，導致脂質合成增加，并通過從頭合成途徑提高瘤內局部雄激素水平［30］?；颊呓邮蹵DT后體內超氧化物歧化酶2的表達水平下降，不僅提高了體內氧化應激水平，而且使幾個參與類固醇代謝的基因表達升高，例如醛酮還原酶1C3、羥基類固醇17-β脫氫酶、11β-羥化類固醇脫氫酶2等，使腎上腺雄烯二酮轉化為睪酮，從而激活AR信號［31-32］，見圖2。這些研究均表明氧化應激在PCa細胞中有促進雄激素合成的可能性。

3.3 氧化應激增加AR對低水平雄激素的敏感性 通過對基因研究發(fā)現，硫氧還蛋白域9（TXNDC9）是ROS誘導劑衣霉素最顯著上調的TRX，也是氧化應激條件下觸發(fā)AR信號通路的重要調節(jié)劑。例如，在沒有ROS誘導劑時，沉默TXNDC9基因導致LNCaP細胞系活力降低，TXNDC9基因過表達也沒能恢復細胞活力，但加入ROS誘導劑后細胞活力和AR活性均有所提高，并且不能被沉默TXNDC9所干擾［33］。同時，過氧化物氧化還原酶蛋白1（Prx1）是TXNDC9主要的相互蛋白，兩者在形成同二聚體時起著抗ROS的作用［33］。然而，與過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶相比，Prx1的催化能力相對較弱，在H2O2催化過程中很容易失活。首先，在ROS誘導劑刺激下，TXNDC9上調并與Prx1解離，一方面通過促進TXNDC9介導的E3泛素連接酶MDM2的降解來激活AR信號傳導，另一方面通過直接增強Prx1結合AR的能力，穩(wěn)定AR蛋白。其次，被ROS誘導劑處理后，Prx1形成聚合物從抗氧化劑功能切換到AR分子伴侶功能，增加雙氫睪酮（DHT）和AR N-C相互作用的親和力，降低DHT與受體解離速率，穩(wěn)定DHT-AR復合物，使AR在低雄激素環(huán)境下仍然保持活化狀態(tài)；相反，Prx1基因敲除則使AR信號活性降低了50%左右［34］，見圖2。因此，PCa患者經過ADT后雖然阻斷了雄激素的主要來源，但提高了AR的敏感性，使其與少量腎上腺來源的雄激素結合能力增強。

除TXNDC9外，硫氧還蛋白域5（TXNDC5）也是TRX家族成員之一，在PCa患者接受ADT后表達上調，并通過硫氧還蛋白結構域形成二硫鍵，促進蛋白質正確折疊和分子伴侶活性，從3個方面增強與AR之間的相互作用：（1）TXNDC5能穩(wěn)定AR結構，促進其核轉位；（2）TXNDC5誘導 HSP90分子伴侶復合物的組裝，穩(wěn)定AR的功能；（3）TXNDC5能提高AR對多種配體的敏感性，使AR對恩扎魯胺產生抗藥性［35］。同時，TXNDC5的表達與ROS介導的缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）呈正相關，首先H2O2介導NF-κB與HIF-1α啟動子上游的結合位點（-197/-188bp）結合，直接激活HIF-1α轉錄；其次H2O2促進核糖體蛋白S6激酶活化，提高HIF-1α的翻譯率［36-37］?？傊?，在轉錄和翻譯水平上，ROS通過介導HIF-1α的表達，上調TXNDC5在PCa細胞中的含量，穩(wěn)定AR功能，以及提高AR對低水平雄激素的敏感性。

3.4 氧化應激介導旁路途經導致AR激活 在CRPC發(fā)展過程中，ROS通過激活腫瘤相關信號通路使AR信號以不依賴雄激素的方式被激活，這些信號通路被稱為“旁路途經”。H2O2通過氧化半胱氨酸殘基抑制受體酪氨酸激酶的蛋白質酪氨酸磷酸酶（PTPs）活性降低，使受體酪氨酸激酶持續(xù)活化，如表皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體等，導致PI3K/Akt信號通路激活［38］，見圖2。AR信號通路與PI3K/Akt/mTOR信號通路之間存在雙向關聯(lián)，當AR信號通路被抑制時，可通過下調靶基因FKBP5的表達，抑制Akt去磷酸化，從而增強PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進腫瘤生長［39］。Akt下游的靶基因叉頭框蛋白A1（FOXA1）與AR結合并共同定位于含有GATA2轉錄因子的染色質上，增強類固醇受體共激活子向FOXA1-AR復合物的募集，促進AR下游基因表達［40］。

H2O2還可以通過激活表皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體，刺激Ras和隨后的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）通路激活。一方面，ERK磷酸化能夠促進AR蛋白質降解，提高低分子量AR的水平，使其能夠以非雄激素依賴的方式進入細胞核與DNA結合，激活或抑制靶基因的轉錄；另一方面，ERK激酶還可以磷酸化并激活AR輔助調節(jié)因子，如NCOA1和NCOA2，促進靶基因轉錄［41］。見圖2。

氧化應激激活p38MAPK信號通路后，下游的激活蛋白1（AP-1）與白介素6（IL-6）基因啟動子區(qū)結合調控IL-6的表達，此外，如前所述與氧化應激相關的幾個轉錄因子如NF-κB和CREB，以同樣方式也參與調節(jié)IL-6的表達［42］，見圖2。隨后IL-6以配體非依賴途徑調控AR活性，促進CRPC演進。首先，IL-6可以替代雄激素功能激活經典的Janus激酶（JAK）/信號轉導與轉錄激活因子（STAT）信號通路［43］。在下游靶基因中，STAT5誘導AR核定位并調控AR轉錄活性激活AR信號通路；STAT3與AR氨基酸N端相互作用并增強AR活性和功能［44］，見圖2。其次，IL-6與IL-6受體JAK結合后，JAK導致含Src同源2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶磷酸化，通過激活Ras并觸發(fā)一系列連鎖事件，使MAPK磷酸化，最終激活AR氨基N端結構域，提高AR靶基因的轉錄活性［45］。IL-6的過度表達也提升了LNCaP細胞中PSA mRNA的表達水平，通過上調翻譯起始因子eIF4A（TIF2）使其在沒有配體的情況下誘導AR活性，保護LNCaP細胞免受ADT誘導的細胞凋亡［46］。見圖 2。

圖2 ROS介導AR信號重激活的分子機制Figure 2 Diagram of the molecular mechanism of ROS mediated reactivation of androgen receptor signals

4 抗氧化應激減緩PCa向CRPC演進

越來越多的證據表明，ADT誘導PCa氧化應激增加，并通過激活AR信號通路參與PCa向CRPC發(fā)生、發(fā)展和轉化。因此，抗氧化應激治療可能在接受ADT的PCa患者中發(fā)揮重要作用。

維生素E是一種抗氧化劑，由8種天然亞型組成，即生育酚的α、β、γ、δ亞型和生育三烯酚的α、β、γ、δ亞型，其中γ-生育酚和δ-生育酚在色原醇環(huán)C-5位置上有未甲基化，因此具有更強的抗氧化能力。大量的基礎研究和觀察性研究表明，維生素E具有抗氧化和預防癌癥的作用，但大規(guī)模人體干預試驗的結果卻顯示其增加了PCa的發(fā)病率［47］；α-生育酚可能增加患PCa的風險，而γ-生育酚可能降低這種風險［48］。γ-生育酚已被證明可以防止核因子E2相關因子2（Nrf-2）啟動子區(qū)域CpG基因的高甲基化，有助于預防氧化應激和PCa的發(fā)生、發(fā)展，降低PCa患者死亡的風險［49］；并且，γ-生育酚的終末氧化產物γ-生育酚醌，比α-生育酚醌能更有效地提高Nrf-2輔助激活轉錄因子4的轉錄活性和細胞抗氧化劑谷胱甘肽的水平［50］。番茄紅素是一種具有抗氧化特性的類胡蘿卜素，通過清除自由基和誘導細胞凋亡發(fā)揮其抗氧化作用［51］。一項研究發(fā)現，在睪丸切除術中加用番茄紅素可使血清PSA水平持續(xù)下降，不僅縮小了原發(fā)腫瘤，而且減少了繼發(fā)腫瘤，與單純睪丸切除術相比提高了患者生存率［52］。同樣，在PC-346C人PCa小鼠模型中，番茄紅素和維生素E的聯(lián)合可以抑制PCa細胞的生長［53］。以上研究提示單純通過降低ROS和氧化應激水平對PCa的抑制作用并不明顯。

Nrf-2是調節(jié)抗氧化反應元件的主要轉錄因子，通過調節(jié)血氧合酶1（HO-1）、NADPH-醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽S-轉移酶A2（GSTA2）等抗氧化物酶，調節(jié)ROS水平［54］。正常情況下，細胞質中Nrf-2與抑制蛋白Keap1結合，通過泛素蛋白酶體途徑促進其降解。氧化應激導致NF-κB釋放和核易位，并在轉錄水平直接抑制Nrf-2活性。通過使用能夠激活 Nrf-2的治療劑，可以預防PCa轉化為CRPC［55］。在PCa中激活Nrf-2不僅能調節(jié)氧化應激水平，而且還可以通過誘導p120-Nrf1的核積累來降低AR的反式激活，以及抑制DHT誘導的AR活性［56］。目前發(fā)現，甲基巴多索隆是一種強效的Nrf-2誘導劑，通過降低AR-FL和AR-V7抑制AR功能，提高耐恩雜魯胺PCa細胞系（CWR22RV1）中恩雜魯胺的療效，可以作為PCa患者接受ADT時的輔助治療［57］。萊菔硫烷（SFN）在PCa中發(fā)揮作用的兩個關鍵途徑是Nrf-2激活和NF-κB抑制。首先，SFN與Keap-1相互作用，消除對Nrf-2的抑制作用，增加小鼠TRAMP C1 PCa細胞Nrf-2的表達，抑制AR轉錄以及降低PCa細胞中AR的穩(wěn)定性［58］；SFN也可以通過降解PCa細胞系中AR-FL和AR-V7，提高雄激素依賴性和雄激素非依賴性PCa細胞系抗雄激素的療效［58］。其次，SFN通過阻礙IKK/IκB磷酸化和p65 NF-κB亞基核易位，阻斷NF-κB信號傳導，抑制AR表達［59］。與SFN相似，在小鼠TRAMP C1 PCa細胞中，姜黃素（CUR）被認為是Keap1抑制劑，通過修飾Keap1 Cys-151的親電性，降低Keap1表達，促進Nrf-2解離，并下調雄激素依賴性和雄激素非依賴性PCa細胞中AR基因的表達和活性［60-61］。

5 結語

綜上所述，氧化應激具有調節(jié)AR信號通路的潛力，是接受ADT后PCa患者復發(fā)以及向CRPC發(fā)生和發(fā)展的重要因素。目前關于PCa抗氧化治療的研究結果提示，單純通過降低ROS和氧化應激水平對抑制CRPC演進的效果并不顯著；而干預氧化應激中部分信號通路對抑制AR活性、預防PCa向CRPC轉化有一定的作用。未來通過深入研究氧化應激以及相關信號途徑對AR信號通路重激活的影響，能有效為CRPC的治療提供新的策略和靶點。

作者貢獻：衡立進行文章的構思與設計，撰寫論文；衡立、張立國進行文獻檢索；衡立、張立國、董婧婷進行文獻整理；李治國、曹鳳宏負責文章的質量控制和審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

本文文獻檢索策略：

PubMed上檢索（Oxdative stress）AND（（castrationresistant prostate cancer）OR（CRPR）OR（prostate cancer））；（Reactive oxygen species）AND（（castration-resistant prostate cancer）OR（CRPR）OR（prostate cancer））；（（Reactive oxygen species）OR（Oxdative stress））AND（cancer）；（（Reactive oxygen species）OR（Oxdative stress））AND（androgen receptor）建庫至2020年的所有相關文章，納入研究前列腺癌相關分子機制以及活性氧的文章，排除Meta分析文章。