孫毅，潘持國(guó)，孫麗麗，李猛，張娣，張凱齊，李超

本研究發(fā)現(xiàn)及改進(jìn)：

通過針對(duì)聽力障礙患者進(jìn)行遺傳性失聰基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在山東地區(qū)GJB2基因235delC位點(diǎn)和SLC26A4基因IVS7-2A＞G位點(diǎn)是遺傳性失聰基因發(fā)病率最高的突變位點(diǎn)；按本研究所采用的4個(gè)常見致聾基因的15個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的微陣列芯片的檢測(cè)方法相對(duì)落后，不能提供準(zhǔn)確的臨床基因診斷；因此，后續(xù)研究中應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行失聰相關(guān)基因的全序列分析，為本地區(qū)失聰基因突變圖譜的繪制提供依據(jù)。

失聰——人和人之間一道無聲的墻，是困擾生活最常見的疾病之一。我國(guó)失聰患者超過3 000萬［1］，其中遺傳因素占60%以上［2-3］。近些年，基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展對(duì)遺傳性失聰分子病因的闡明起了巨大推動(dòng)作用，使早診斷、早發(fā)現(xiàn)成為現(xiàn)實(shí)，通過對(duì)聽力障礙患者進(jìn)行基因檢測(cè)、分析病因，可預(yù)估下一代患病風(fēng)險(xiǎn)。但不斷改進(jìn)的分子診斷技術(shù)一方面可提高檢出率，另一方面也面臨著新檢測(cè)技術(shù)帶來的數(shù)據(jù)分析困難和變異解讀的不確定性等問題。因此在聽力障礙患者中開展能明確病因的基因檢測(cè)和遺傳咨詢十分必要。研究表明我國(guó)失聰患者致病熱點(diǎn)基因有4個(gè)［4-5］。本研究利用基因芯片技術(shù)對(duì)山東省聽力障礙患者進(jìn)行4種常見致聾基因的15個(gè)突變位點(diǎn)基因檢測(cè)，進(jìn)一步了解山東地區(qū)失聰患者基因突變情況、完善山東省聾病的分子流行學(xué)資料，為聽力殘疾預(yù)防提供參考，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)防聾減殘、提高人口素質(zhì)的目的。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 對(duì)2016—2020年參加山東省聽力障礙人士失聰基因檢測(cè)項(xiàng)目的5 664例持聽力殘疾證或持聽力診斷證明的聽力障礙患者進(jìn)行遺傳性失聰基因篩查檢測(cè)，＜18歲2 527例，18～30歲2 036例，＞30歲1 101例；男2 106例，女3 558例；持聽力殘疾二級(jí)及以上證件者4 429例，持聽力殘疾三級(jí)及以下證件者1 183例，余52例持多重殘疾證件。樣本采集前相關(guān)專業(yè)醫(yī)護(hù)人員向研究對(duì)象簡(jiǎn)單介紹聽力檢測(cè)及失聰基因檢測(cè)，并指導(dǎo)其填寫《檢測(cè)人員信息登記表》，包括基本信息、失聰發(fā)病年齡、家族史、耳毒性藥物應(yīng)用史、創(chuàng)傷史等，簽署知情同意書。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意〔倫理審批編號(hào)：2021-（3）〕。

1.2 聽力檢測(cè) 使用純音測(cè)聽法檢測(cè)患者聽力，根據(jù)我國(guó)2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查診斷標(biāo)準(zhǔn)中的0.5、1、2、4 kHz的聽閾均值進(jìn)行計(jì)算。聽力殘疾一級(jí)，平均聽閾≥91 dB HL；聽力殘疾二級(jí)，平均聽閾81～90 dB HL；聽力殘疾三級(jí)，平均聽閾61～80 dB HL；聽力殘疾四級(jí)，平均聽閾41～60 dB HL。

1.3 失聰基因檢測(cè)方法 對(duì)聽力障礙人士進(jìn)行15項(xiàng)遺傳性失聰檢測(cè)，采用博奧晶典核酸提取試劑盒（貨號(hào)：360100-01）提取外周血基因組DNA，使用擴(kuò)增儀對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，最后使用博奧晶典生物技術(shù)有限公司LuxScanTM 10K-A微陣列芯片掃描儀對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)判讀。每次檢測(cè)均包含陰性和陽性對(duì)照，以驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)所有芯片陽性結(jié)果進(jìn)行Sanger測(cè)序復(fù)核，同時(shí)隨機(jī)抽取5%的陰性結(jié)果樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.4 遺傳咨詢方案 通過基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)已知的遺傳方式和突變位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的解讀說明，并給予患者生活指導(dǎo)卡和用藥指導(dǎo)卡；對(duì)于有生育需求的患者給予生育風(fēng)險(xiǎn)指導(dǎo)卡，告知生育風(fēng)險(xiǎn)或再生育風(fēng)險(xiǎn)，開展遺傳咨詢，從而減少失聰兒出生。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢測(cè)情況 5 664例聽力障礙患者中，聽力殘疾一級(jí)3 891例，聽力殘疾二級(jí)1 463例，聽力殘疾三級(jí)188例，聽力殘疾四級(jí)73例，其余49例（小耳畸形38例，外耳道封閉11例）。

2.2 失聰基因檢測(cè)情況 5 664例聽力障礙患者檢測(cè)出失聰基因突變2 503例（44.19%），分別為GJB2基因突變1 227例（21.66%），確診致病突變691例（12.20%）；SLC26A4基因突變975例（17.21%），確診致病404例（7.13%）；線粒體12SrRNA基因突變97例（1.71%）；GJB3基因突變158例（2.79%）；雙基因雜合突變46例（0.81%）。顯示基因結(jié)果正常3 161例，未發(fā)現(xiàn)攜帶致聾基因，詳見表1～3。

表1 5 664例聽力障礙患者的GJB2基因檢測(cè)情況（n=5 664）Table 1 Genetic testing for GJB2 gene mutations in 5 664 hearingimpaired patients

表2 5 664例聽力障礙患者SLC26A4基因檢測(cè)情況（n=5 664）Table 2 Genetic testing for SLC26A4 gene mutations in 5 664 hearingimpaired patients

表3 5 664例聽力障礙患者其他基因檢測(cè)情況（n=5 664）Table 3 Genetic testing for mutations in mitochondrial 12S rRNA gene，GJB2+ SLC26A4 genes，and GJB3 gene in 5 664 hearing-impaired patients

2.3 不同基因在失聰聽力等級(jí)中例數(shù)的分布情況 GJB2、SLC26A4基因突變?cè)诼犃Φ燃?jí)中比較一致，屬于熱點(diǎn)突變，而12rRNA、GJB3和雙基因突變?cè)诼犃Φ燃?jí)中分布差別很大，見表4。攜帶GJB2基因、攜帶SLC26A4基因突變患者聽力一級(jí)、二級(jí)分布情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表4 不同失聰基因在失聰聽力等級(jí)中例數(shù)分布情況Table 4 Number of hearing-impaired patients carrying mutations in each of the four common genes related to hereditary deafness or double heterozygous mutations by the grade of hearing disability

表5 GJB2、SLC26A4基因變異患者聽力一、二級(jí)分布〔n（%）〕Table 5 Prevalence of GJB2 and SLC26A4 gene mutations in hearingimpaired patients by the grade of hearing disability

3 討論

失聰是最常見的出生缺陷之一，發(fā)病率高，異質(zhì)性明顯，在我國(guó)聽力殘疾患者數(shù)量位居各類殘疾之首［6］，約占?xì)埣踩巳旱?3.5%［7］。遺傳性失聰分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X或者Y連鎖和線粒體突變母系遺傳4種遺傳方式，70%的遺傳性失聰是以失聰為唯一的癥狀，不伴有其他臨床表現(xiàn)或疾病的非綜合征性失聰［8-10］。

本研究中的5 664例聽力殘疾患者經(jīng)本院聽力檢測(cè)定級(jí)結(jié)果存在差異，經(jīng)討論交流發(fā)現(xiàn)可能是因?yàn)闄z測(cè)設(shè)備，檢測(cè)環(huán)境和操作人理論知識(shí)儲(chǔ)備不足造成的［11］。因此基層聽力設(shè)備更新?lián)Q代、聽力測(cè)試環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、聽力評(píng)估方法統(tǒng)一、聽力評(píng)估人才規(guī)范化培養(yǎng)等急需國(guó)家統(tǒng)籌解決。

本研究使用15項(xiàng)遺傳性失聰基因篩查微陣列芯片，對(duì)山東5 664例持證的聽力障礙患者進(jìn)行基因檢測(cè)。微陣列基因芯片技術(shù)，其基本原理是分子雜交，即通過特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針，將樣本通過 PCR 擴(kuò)增進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后與芯片探針按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行雜交，最后通過自動(dòng)化儀器檢測(cè)雜交或反應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度，從而得出基因表達(dá)或突變的信息。本研究使用博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的中國(guó)人群中高發(fā)致病的4個(gè)基因15個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)芯片，這種芯片每次可以同時(shí)檢測(cè)四個(gè)患者，可同時(shí)平行檢測(cè)多張芯片，具有通量高、檢測(cè)速度快、自動(dòng)化程度快等優(yōu)勢(shì)。本研究的檢出率為44.19%，可滿足聽力障礙患者臨床失聰基因檢測(cè)的需求。但是本方法只能檢測(cè)已知的致病基因，無法發(fā)現(xiàn)未知的遺傳性失聰突變個(gè)體，易造成漏診，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋檢測(cè)結(jié)果［12］。本研究中檢測(cè)到2 503例攜帶失聰相關(guān)致聾基因突變，其中1 227例發(fā)生GJB2基因突變，975例發(fā)生SLC26A4基因突變，而這兩個(gè)基因也是最主要的致病基因，與全國(guó)失聰人群檢測(cè)統(tǒng)計(jì)一致［13-15］。GJB2基因位于人類13號(hào)染色體上，含有2個(gè)外顯子，其中，235delC突變位點(diǎn)在GJB2基因的攜帶率為85.00%，是本研究聽力障礙患者中最常見的致病突變位點(diǎn)，與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致［16］。SLC26A4基因又稱PDS基因，位于人類7號(hào)染色體，含有21個(gè)外顯子，IVS7-2A＞G位點(diǎn)突變?cè)赟LC26A4基因，攜帶率為78.56%，亦是本研究聽力障礙患者中僅次于GJB2基因235delC位點(diǎn)的第二熱點(diǎn)致病突變，是SLC26A4基因的最高致病突變［17］。線粒體12SrRNA基因突變97例，只要檢測(cè)到該突變存在，不論均質(zhì)還是異質(zhì)突變，均提示患者對(duì)氨基糖苷類抗生素敏感，需防止 “一針致聾”的悲劇發(fā)生［18-19］。研究中還檢測(cè)到GJB3基因c.538C＞T位點(diǎn)突變158例，其遺傳方式可為常染色體隱性遺傳或顯性遺傳，在不同性別表現(xiàn)異質(zhì)性［20-21］。對(duì)于顯性遺傳性失聰檢測(cè)，還要注意失聰發(fā)生存在遲發(fā)性和失聰外顯不全等情況［22］。

對(duì)失聰患者的基因檢測(cè)，可以使患者或家屬了解遺傳性失聰?shù)陌l(fā)病情況，采取針對(duì)性的婚育指導(dǎo)，降低聾病對(duì)家庭的影響［23-25］。失聰基因檢測(cè)一般包括檢測(cè)前的咨詢問診和檢測(cè)后的遺傳咨詢，通過檢測(cè)前的咨詢問診可以判定聾病的性質(zhì)、聽力損失變化情況、遺傳家族史、致聾因素及發(fā)生時(shí)間等［20，26］，而通過基因檢測(cè)可以明確致聾原因。

聾-聾同證婚配是我國(guó)失聰人群最常見的婚配方式，目前我國(guó)婚齡段聽力殘疾人群在殘疾人相關(guān)企業(yè)中呈同證聚集狀態(tài)或與其他類殘疾人聚集狀態(tài)，對(duì)失聰者及其配偶進(jìn)行聾病易感基因檢測(cè)和干預(yù)可減少下一代聾兒的出生，提升人口素質(zhì)［27］。在失聰患者基因檢測(cè)病因分析過程中，臨床表型必須與基因檢測(cè)結(jié)果一同分析。對(duì)于單純進(jìn)行婚育指導(dǎo)的患者務(wù)必明確其是否有家族史、是否有相同臨床癥狀和相同致聾基因突變。對(duì)于常見的GJB2或者SLC26A4基因檢查未通過者，配偶應(yīng)進(jìn)行基因檢測(cè)以及進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷或植入前診斷，以預(yù)防新生兒聽力殘疾發(fā)生［28-29］。通過對(duì)未婚聽力障礙人群失聰基因的檢測(cè)，明確遺傳性失聰發(fā)病情況，可避免因兩人攜帶相同致聾基因突變而增加生育聽力障礙患兒的風(fēng)險(xiǎn)。本研究使用的芯片法失聰基因檢測(cè)覆蓋基因點(diǎn)位少，確診率低。因此，建議未明確病因的患者通過高通量測(cè)序檢測(cè)，盡可能地明確病因，進(jìn)而有效阻斷遺傳性失聰基因在失聰家庭中的傳遞［30］。

根據(jù)“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要指示精神及《殘疾預(yù)防和殘疾人康復(fù)條例》要求，各級(jí)殘疾人聯(lián)合會(huì)和各級(jí)康復(fù)醫(yī)院，運(yùn)用專業(yè)手段定期對(duì)聽力損失人群檢測(cè)調(diào)查，判定聾病發(fā)展情況，分析致殘?jiān)?，?shí)施動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為臨床診斷提供依據(jù)。本研究通過規(guī)范開展遺傳性失聰基因檢測(cè)、遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)，盡可能揭示山東省聽力殘疾人群病因的同時(shí)，積極開展失聰三級(jí)疾病預(yù)防，降低失聰患兒的出生率［31］。

綜上所述，隨著醫(yī)療水平的提高，殘疾預(yù)防理念深入人心，經(jīng)過一定周期的遺傳干預(yù)，聽力障礙患者在人群中的比例或許會(huì)有很大改善，從根本上降低遺傳性失聰?shù)陌l(fā)病率，將會(huì)產(chǎn)生極大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

作者貢獻(xiàn)：孫毅進(jìn)行研究設(shè)計(jì)和實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)論文負(fù)責(zé)；潘持國(guó)、孫麗麗、李猛、張娣、張凱齊進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、材料收集；李超進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。