常軍帥，張琪，林津如，屈勇剛，梁晏，李娜，黨瑞瑩，王紫陽

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

奶牛養(yǎng)殖業(yè)是新疆的一個(gè)支柱性產(chǎn)業(yè)，奶牛乳房炎（Bovine mastitis）對(duì)該區(qū)奶業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生了一定的影響。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界約1/3的奶?；加胁煌愋偷娜榉垦?，我國部分養(yǎng)殖場超過50%的奶?；加腥榉垦?，損失巨大[1,2]。大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的常見病原菌之一，占總發(fā)病率的17.6%～34.5%[3,4]。市場上雖有大腸桿菌亞單位疫苗，但因大腸桿菌血清型多，暫未能取得理想的預(yù)防效果，目前仍以抗生素治療作為治療乳房炎的主要手段?？股卦谏a(chǎn)中的不合理使用，導(dǎo)致了大腸桿菌的耐藥機(jī)制呈現(xiàn)出了多元化。Tomazi等[5]發(fā)現(xiàn)巴西276株牛源大腸桿菌對(duì)紅霉素、苯唑西林、青霉素等耐藥率超過了70%；張亞茹[6]對(duì)甘肅地區(qū)41份牛源大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)利福平、克林霉素和萬古霉素的耐藥率超過了90%。引發(fā)奶牛乳房炎的大腸桿菌都具有一定的致病性，致病性通常與毒力基因呈正相關(guān)，大腸桿菌毒力基因的相關(guān)毒力因子主要包括黏附素、腸毒素、志賀毒素、毒力島ETT2等。張艷等[2]用0.5mL的奶牛乳房炎源大腸桿菌以1×108CFU/mL的濃度對(duì)小鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攻毒組小鼠的心臟、肝臟明顯腫大；高娃等[7]用大腸桿菌對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4h內(nèi)小鼠便可死亡。因此，對(duì)乳房炎奶樣中大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、毒力基因檢測及小鼠致病性試驗(yàn)，可為大腸桿菌的流行病學(xué)調(diào)查提供參考，也可指導(dǎo)治療臨床型乳房炎時(shí)藥物的合理使用。為此，筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)新疆部分地區(qū)臨床型乳房炎源大腸桿菌的感染率、耐藥情況及致病情況進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料

1.1 試劑與藥品

奶牛乳房炎快速診斷試劑（PH2004111），購自生泰爾（內(nèi)蒙古）科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；麥康凱、伊紅美藍(lán)等試劑，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購自青島海博生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；頭孢哌酮（CFP,75μ g/片）、頭孢曲松（CRO,30μ g/片）、紅霉素（ERY,15μg/片）、阿米卡星（AMK,30μ g/片）、慶大霉素（GEN,10μ g/片）、強(qiáng)力霉素（DO,30μg/片）、恩諾沙星（ENR,10μ g/片）、氯霉素（CHL,30μg/片）、萬古霉素（VAN,30μ g/片）、復(fù)方新諾明（STX,1.25/23.75μg/片）、呋喃唑酮（FR,300μg/片）等藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)小鼠24只（不分雌雄），體重約20g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要儀器

體細(xì)胞檢測儀，購自華誠睿光（中國）生物科技有限公司；超凈工作臺(tái)，購自上海鴻都電子科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀，購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法

2.1 乳樣的采集

根據(jù)臨床表現(xiàn)，對(duì)乳房紅腫、乳樣異常的奶樣進(jìn)行加州乳房炎測試法（CMT）檢測，并用體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）儀進(jìn)行復(fù)檢，判定標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，若兩種檢測方法有所誤差，需重新檢測，并以SCC結(jié)果為準(zhǔn)。對(duì)確診乳區(qū)的奶樣，無菌采集，4℃保存。

2.2 大腸桿菌的分離純化

無菌操作，用滅菌棉簽蘸取奶樣四區(qū)劃線于LB肉湯瓊脂平板上，倒置放于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)。挑取典型的大腸桿菌單菌落，再次四區(qū)劃線于LB肉湯瓊脂平板上。反復(fù)操作3次以上，直到單個(gè)菌落區(qū)上的每個(gè)菌落大小、形狀、顏色一致，于載玻片上干燥固定，革蘭氏染色后，油鏡下觀察形態(tài)、純度及染色特征。

純化好的細(xì)菌用無菌接種環(huán)四區(qū)劃線于麥康凱瓊脂平板上，倒置放于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)。用滅菌接種環(huán)挑取粉紅色濕潤菌落四區(qū)劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，菌落帶有金屬光澤的初步判定為大腸桿菌，再進(jìn)一步進(jìn)行三糖鐵試驗(yàn)。

2.3 大腸桿菌的生化試驗(yàn)

按說明書進(jìn)行無菌操作，取純化好的菌液進(jìn)行大腸桿菌微量生化反應(yīng)試驗(yàn)，置于滅菌容器內(nèi)，放37℃恒溫培養(yǎng)箱，18～24h后觀察記錄結(jié)果。

2.4 大腸桿菌的PCR鑒定

按照天根細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒的操作說明，提取的細(xì)菌DNA可直接用于PCR擴(kuò)增。引物序列參考文獻(xiàn)[9]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成大腸桿菌特異性引物,引物序列為：F：5'-GGTAACGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'；R：5'-CAGGGTTGGTACACTGTCATTACG-3'。PCR反應(yīng)體系（20μL）：2×Taq PCR Master Mix 10μL，菌液模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 6μ L。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取7μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，預(yù)期產(chǎn)物大小為468bp。

2.5 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)

將鑒定為大腸桿菌的分離株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（OD600≈0.5）。采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，用無菌涂布器將200μL的純菌液均勻涂布于LB瓊脂平板上，待平板干燥后，按照兩藥敏紙片中心間距不小于24mm、紙片邊距平皿大于15mm的原則貼藥敏紙片于瓊脂平板的表面，倒置放于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察并測量抑菌圈直徑（mm），參照美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[10]。

2.6 毒力基因檢測

選擇大腸桿菌7個(gè)毒力基因：Stx2、sep2、sta、hlyA、K99、ETT2和eaeA，引物序列參考文獻(xiàn)[11]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，對(duì)分離出的大腸桿菌進(jìn)行核酸提取。PCR反應(yīng)條件的退火溫度依據(jù)表1，其他按照方法2.4進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀內(nèi)觀察是否出現(xiàn)目的條帶。

表1 PCR引物信息

2.7 小鼠攻毒試驗(yàn)

將含多種類型毒力基因的大腸桿菌作為攻毒株，毒力基因完全一致的選一株即可，每組6只，同時(shí)設(shè)立1組健康對(duì)照組。參照有關(guān)文獻(xiàn)[11]，將攻毒組菌液濃度定為1×108CFU/mL，腹腔注射，注射量為0.5mL/只。健康組每只小鼠腹腔注射0.5mL的PBS。注射后觀察小鼠的精神狀態(tài)，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行剖檢觀察病變并無菌采集肝臟進(jìn)行病原菌檢測。同時(shí)剖檢陰性小鼠，作為對(duì)比。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床型乳房炎乳樣采集結(jié)果

通過臨床檢查（圖1A）及CMT（圖1B）檢測出53個(gè)乳區(qū)為臨床型乳房炎，通過SCC復(fù)檢（圖1C）后發(fā)現(xiàn)有47份乳樣體細(xì)胞數(shù)＞5×106個(gè)/mL，被確診為臨床型乳房炎乳樣。

圖1 臨床型乳房炎的檢測

3.2 大腸桿菌分離與鑒定結(jié)果

從4 7份樣品中共分離出1 4株大腸桿菌（E1～E14），分離率為29.79%(14/47)。純化好的大腸桿菌經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下為紅色桿狀（圖2A）。菌落在LB肉湯瓊脂平板上為邊緣光滑整齊、濕潤、凸起的灰白色圓形菌落；在麥康凱瓊脂平板上為邊緣光滑整齊、粉紅色、凸起的圓形菌落（圖2B）；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上為帶金屬光澤、凸起的紫黑色圓形菌落（圖2C），在三糖鐵試驗(yàn)中，瓊脂柱變?yōu)辄S色，部分有氣泡產(chǎn)生，斜面菌落呈淡黃色（圖2D）。

圖2 大腸桿菌的特性

3.3 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

14株大腸桿菌的吲哚試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)都為陽性，VP試驗(yàn)、Koreser氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)皆為陰性，對(duì)各種糖的分解略有不同，符合大腸桿菌的生化特性（圖3）。

圖3 部分生化試驗(yàn)（左為陰性對(duì)照）

3.4 大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

通過P C R鑒定，1 4株大腸桿菌的條帶均在400～500bp之間，且與陽性對(duì)照一致，為468bp，與預(yù)期大小一致（圖4）。

圖4 大腸桿菌的RCR鑒定

3.5 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在11種藥敏試驗(yàn)中，14株大腸桿菌都具有多重耐藥性，最少的為3重耐藥，最多的為11重耐藥。其中CFP、CRO、ERY、DO、ENR、CHL、FR的耐藥率超過了85.71%；9重及以上耐藥的菌株占總數(shù)的71.43%（10/14）。結(jié)果見表2、圖5。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖5 多重耐藥性結(jié)果

3.6 毒力基因檢測結(jié)果

本試驗(yàn)檢測了大腸桿菌的7個(gè)毒力基因，結(jié)果顯示，Stx2、hlyA、K99、ETT2和eaeA這5種毒力基因均被檢測出，其中有4株菌具有多種毒力基因，占總數(shù)的28.57%。結(jié)果見表3、圖6。

表3 毒力基因檢出結(jié)果

圖6 部分毒力基因PCR檢測結(jié)果

3.7 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒后，小鼠精神狀態(tài)逐步變差，48h內(nèi)第1組死亡2只小鼠，第2組死亡3只小鼠，第3組死亡4只小鼠，健康對(duì)照組未有小鼠死亡（表4）。剖檢死亡小鼠均發(fā)現(xiàn)：皮下充血，十二指腸腸壁變薄，肝臟有出血點(diǎn)；健康小鼠一切正常（圖7）。無菌采集攻毒組小鼠的肝臟進(jìn)行PCR鑒定，均鑒定出了大腸桿菌。

表4 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

圖7 小鼠攻毒試驗(yàn)

4 討論

本次采樣季節(jié)為7月份，是環(huán)境型乳房炎高發(fā)季節(jié)，所以本次試驗(yàn)將大腸桿菌作為目標(biāo)菌進(jìn)行分離鑒定。通過常規(guī)方法分離純化細(xì)菌后再用特異性PCR鑒定，確定出了14株大腸桿菌，分離率為29.79%（14/47），高于朱寧等[12]報(bào)道的上海地區(qū)臨床型乳房炎患牛乳中大腸桿菌的分離率(15.5%)和王曉等[13]報(bào)道的某荷斯坦牛場牛奶中大腸桿菌的分離率(15.5%)，低于苑曉萌等[14]報(bào)道的成都地區(qū)牛奶中大腸桿菌的分離率（38.1%）。

經(jīng)對(duì)14株大腸桿菌進(jìn)行11種抗生素的藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：對(duì)頭孢哌酮和萬古霉素的二重耐藥率高于71.43%（10/14）；對(duì)頭孢哌酮+頭孢曲松+紅霉素+慶大霉素+強(qiáng)力霉素+恩諾沙星+氯霉素+萬古霉素+復(fù)方新諾明+呋喃唑酮的多重耐藥，高達(dá)50.00%（7/14）。馬博等[15]發(fā)現(xiàn)從石河子地區(qū)某規(guī)?；膛龇蛛x出的大腸桿菌，對(duì)林可霉素、青霉素、桿菌肽、紅霉素的耐藥率都超過了90%；倪春霞等[16]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古、甘肅、四川和上海4地部分奶牛場中的大腸桿菌對(duì)青霉素和萬古霉素有較強(qiáng)耐藥。這說明我國大部分地區(qū)奶牛場的大腸桿菌普遍出現(xiàn)對(duì)青霉素的耐藥現(xiàn)象，對(duì)其他藥物的耐藥現(xiàn)象差異較大。毒力基因檢測結(jié)果顯示，hlyA檢出率最高，為28.57%（4/14）；ETT2的檢出率只有21.43%（3/14），遠(yuǎn)低于汪強(qiáng)榮的檢出率（95.16%），推測是由于不同地區(qū)菌株差異所導(dǎo)致[11]。在小鼠攻毒試驗(yàn)中，大腸桿菌主要造成小鼠皮下充血、十二指腸和肝臟出現(xiàn)病變，與高娃等[7]研究結(jié)果相同，說明菌株含毒力基因數(shù)量的增加與菌株的致病性呈正相關(guān)，增加了乳房炎的發(fā)病率。

大腸桿菌為條件性病原菌，并非不可控，所以生產(chǎn)中要提高飼養(yǎng)管理水平，尤其是要做好圈舍墊料的替換及擠奶時(shí)乳頭的消毒工作。針對(duì)耐藥嚴(yán)重的地區(qū)，可以嘗試噬菌體或益生菌等生物制劑來積極應(yīng)對(duì)抗生素危機(jī)。