楊顯超，楊德全，陶田谷晟，鞠厚斌，王建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的一種以腹瀉、胃腸炎、消化道黏膜腐爛和壞死為特征的持續(xù)性、接觸性的傳染病。該病在世界流行廣泛，已經(jīng)對(duì)全球養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重危害，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須上報(bào)的疫病。目前，我國(guó)的BVD流行范圍廣且日益嚴(yán)重、流行毒株基因型眾多，流行特點(diǎn)及流行趨勢(shì)不斷出現(xiàn)新特點(diǎn)，危害十分嚴(yán)重，對(duì)BVD的防控提出了新的挑戰(zhàn)。本文就BVDV的基因分型、流行情況、診斷方法和防控策略等方面作一綜述，以期為BVD的防控工作提供新思路、新對(duì)策。

1 牛病毒性腹瀉病毒的基因分型

BVDV基因分型是追蹤BVDV傳播、變異以及持續(xù)感染等極為有效的方法，對(duì)了解病毒起源、分布和流行具有重要意義。根據(jù)基因組5’UTR的差異，BVDV可分為BVDV1型和BVDV2型兩種基因型[1]。到目前為止，BVDV1型已被分為22個(gè)基因亞型(1a～1v)[2]。我國(guó)已有多種亞型的報(bào)道，2006年確定了豬源ZM-95株為1m亞型[3]；2013年蘭州獸醫(yī)研究所首次報(bào)道了我國(guó)西部地區(qū)存在BVDV1q亞型[4]；2015年我國(guó)學(xué)者調(diào)查表明BVDV1m亞型為國(guó)內(nèi)主要流行毒株，其次為1b和1u亞型，其中1u為國(guó)內(nèi)首次確認(rèn)存在的新基因亞型[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者朱遠(yuǎn)茂等[6]對(duì)分離到的一株BVDV毒株LJ36/14首次定型為BVDV1v亞型。BVDV2型分為BVDV2a、2b、2c和2d4個(gè)亞型[7]。Ridpath等[8]于2010年建議將BVDV2型分為2個(gè)亞型，即2a和2b。任敏等[9]、李慶超等[10]在山東、新疆和吉林均分離到BVDV2a亞型毒株，王煒等[11]于2014年在山東分離到BVDV2b亞型毒株。可見，國(guó)內(nèi)BVDV流行毒株基因亞型復(fù)雜多樣。

2 牛病毒性腹瀉病毒的流行狀況

BVDV于1946年首次在北美洲發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)呈全球性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)許多國(guó)家血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[12]：美國(guó)牛血清樣品BVDV陽(yáng)性率為50%，澳大利亞為89%，智利、烏拉圭、秘魯、巴西、阿根廷及哥倫比亞等南美國(guó)家平均陽(yáng)性率高達(dá)85%。我國(guó)于1980年首次在吉林省發(fā)現(xiàn)該病毒[13]，此后，陳永僩等[14]在北京和四川省送檢的奶牛和牦牛血清樣品中首次檢測(cè)到BVDV的中和抗體，從血清學(xué)上證實(shí)了我國(guó)有BVDV感染的存在。隨后許多學(xué)者[15～22]對(duì)國(guó)內(nèi)多個(gè)省區(qū)進(jìn)行了BVDV的流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查結(jié)果表明，天津、陜西、甘肅、寧夏、青海、安徽、江蘇、廣西、黑龍江、重慶、新疆、山西、山東、河南、河北、吉林、湖北、內(nèi)蒙古、遼寧、江蘇、西藏和福建等20多個(gè)省區(qū)市均有本病的發(fā)生。流行病學(xué)調(diào)查表明，各地區(qū)存在不同程度的感染，且有逐年升高的態(tài)勢(shì)[18]，而且一些地區(qū)感染相當(dāng)嚴(yán)重[20,23]。國(guó)內(nèi)學(xué)者Ran等[24]檢索國(guó)內(nèi)2003年3月-2018年3月關(guān)于奶牛BVDV發(fā)病率和流行率的論文數(shù)據(jù)，運(yùn)用meta分析法進(jìn)行系統(tǒng)的回顧和評(píng)價(jià)，結(jié)果表明我國(guó)奶牛BVDV的總陽(yáng)性率為53.0%（95% CI 40.2～65.7），其中福建省奶牛群BVDV陽(yáng)性率最高達(dá)90.0%，其次為陜西?。?8.9%）和山東?。?3.3%）。同時(shí)也證實(shí)了在過(guò)去的十年里國(guó)內(nèi)奶牛BVDV的感染呈不斷擴(kuò)大并廣泛傳播的趨勢(shì)。

3 診斷方法

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和特征性病理變化等可作初步的診斷。如需進(jìn)一步診斷，須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診。

3.1 病毒分離

牛腎、脾和睪丸等多種牛源細(xì)胞均可用于BVDV的分離。李佑民等[13]在上世紀(jì)80年代用初生牛腎原代和次代細(xì)胞從流產(chǎn)胎兒脾臟中首次分離到該病毒。1983年，有學(xué)者用犢牛腎或睪丸細(xì)胞分離到一株BVDV。1986年中國(guó)獸藥監(jiān)察所用牛腎傳代細(xì)胞也分離到該病毒。如今，牛腎細(xì)胞已成為分離BVDV最常用的細(xì)胞。但這種方法對(duì)試驗(yàn)條件要求比較高，不適于大規(guī)模的病毒檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，只適用于致細(xì)胞病變型的BVDV的分離鑒定。

3.2 血清學(xué)檢查

3.2.1 免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)因操作簡(jiǎn)單易行，在基層獸醫(yī)應(yīng)用比較廣泛。但其不具備株特異性，準(zhǔn)確率不高，易造成漏檢。

3.3.2 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)為國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)，也是BVDV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法可定性定量檢測(cè)，敏感性較瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高，重復(fù)率好，適用于BVDV疫苗免疫效果評(píng)估和血清流行病學(xué)調(diào)查評(píng)估。但是，由于該方法試驗(yàn)操作復(fù)雜且耗時(shí)，還容易受到各種因素干擾，目前已經(jīng)不經(jīng)常使用。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)包括檢測(cè)抗體的間接ELISA和檢測(cè)抗原的抗原捕獲ELISA，具有操作簡(jiǎn)便、快速、通量高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于BVDV的抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。高欲燃建立了間接ELISA方法用于檢測(cè)血清中BVDV E2蛋白抗體，與中和試驗(yàn)的符合率非常好，適合大量血清樣品的高通量檢測(cè)[25]。范晴等[26]建立了檢測(cè)BVDV抗原的捕獲ELISA方法，與RT-PCR的符合率為100%，可用于BVDV抗原的檢測(cè)。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

根據(jù)已知的BVDV的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，RTPCR可高度靈敏、特異快速地檢測(cè)病毒RNA；或利用不同基因型中保守序列的差異分別設(shè)計(jì)引物，對(duì)BVDV進(jìn)行基因分型。王偉利等[27]根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設(shè)計(jì)特異性引物用于建立檢測(cè)BVDV的RT-PCR方法，結(jié)果顯示與病毒分離試驗(yàn)的符合率達(dá)100%。根據(jù)BVDV1型和BVDV2型5’UTR序列的差異，分別設(shè)計(jì)特異性引物，建立可同時(shí)檢測(cè)BVDV1型和BVDV2型的RT-PCR方法，可用于BVDV的快速分型檢測(cè)[28]。

3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法與RT-PCR檢測(cè)方法相比，具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)BVDV進(jìn)行早期診斷，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病源，且可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。陳其兵等[29]根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化建立了熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。

3.3.3 熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）

熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于BVDV的檢測(cè)，靈敏度高、特異性好，且具有成本低、快速的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為BVDV的檢測(cè)提供了新的技術(shù)方法，對(duì)BVDV的有效防制具有重要意義。國(guó)內(nèi)學(xué)者根據(jù)BVDV 5’UTR保守序列設(shè)計(jì)了多條特異性引物，建立了BVDV的RT-LAMP快速檢測(cè)方法[30,31]，為該病的檢測(cè)增添了光彩。

4 防控措施

流行性腹瀉是世界養(yǎng)牛業(yè)的一種重要疫病，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，很多發(fā)達(dá)國(guó)家非常重視本病的防控和凈化。目前，發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)BVD的防控策略主要分為兩種：一種是不使用疫苗的“篩查-淘汰”策略，這一策略需要嚴(yán)格的生物安全管理，適合低密度養(yǎng)牛地區(qū)，已在北歐的瑞典、挪威等一些國(guó)家取得了成功。另一種是使用疫苗的“免疫-淘汰”策略，適合高密度養(yǎng)牛地區(qū)，已在美國(guó)和德國(guó)取得成功。借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家防控BVD的成功經(jīng)驗(yàn)，制定符合我國(guó)國(guó)情的防控策略，已成為控制BVD的當(dāng)務(wù)之急?；谖覈?guó)目前BVDV的感染狀態(tài)，“免疫-淘汰”策略更適合我國(guó)當(dāng)前牛場(chǎng)的BVDV控制[32]。

4.1 疫苗免疫

國(guó)外防控經(jīng)驗(yàn)證明，疫苗免疫在防控和凈化BVDV中發(fā)揮了有效的作用，是防控本病的一個(gè)重要手段。鑒于我國(guó)各地牛群BVDV感染很普遍且血清抗體陽(yáng)性率很高，用疫苗高密度全群免疫，可以提升整體抗體水平，阻斷牛群個(gè)體間的傳播途徑，有效遏制BVDV的循環(huán)感染。

4.2 定期監(jiān)測(cè)

定期對(duì)牛群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以全面了解牛群感染與免疫狀態(tài)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰病牛，控制傳染源。同時(shí)可便于調(diào)整并完善免疫方案，確保最佳免疫效果。

4.3 淘汰持續(xù)性感染牛（PI牛）

PI牛是BVDV的最主要傳染源，及早篩查發(fā)現(xiàn)并淘汰PI牛，對(duì)本病的防控具有重要意義。其是有效控制和凈化BVDV的最佳方法，是保障牛群長(zhǎng)期安全的關(guān)鍵措施。

4.4 加強(qiáng)生物安全工作

要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施，全面提高防疫管理水平，嚴(yán)格控制牛只的移動(dòng)，加強(qiáng)牛只的檢疫和管理，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，做好引種、引精工作，切斷BVDV的外來(lái)傳播途徑。通過(guò)對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制，最終達(dá)到控制和凈化BVD的目的。