趙烜影，郭鸰，任大喜，李楠，李玲，劉振民

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200072；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150038；3.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530002）

據(jù)FAO統(tǒng)計，2019年世界水牛乳年產(chǎn)量約1.34億t，占牛乳總產(chǎn)量的15%，僅次于荷斯坦牛乳。由于水牛乳的乳脂、乳蛋白等主要乳成分與荷斯坦牛乳存在較大差異，使得水牛乳在生產(chǎn)、加工和消費(fèi)上占有一定優(yōu)勢[1]。我國水牛乳多直接用于鮮乳加工，缺乏水牛乳深加工的基礎(chǔ)研究，需要挖掘其營養(yǎng)價值并提高利用度[2]。

酪蛋白是一種主要的乳蛋白，存在多態(tài)性[3]。酪蛋白的多態(tài)性主要是由氨基酸的缺失或置換以及糖基化、磷酸化位點的差異引起的[4,5]。β-CN作為水牛乳中含量最高的酪蛋白（35.4%），因能分解多種功能性多肽而得到研究者們的重視，它被認(rèn)為是具有免疫刺激和ACE抑制活性的肽的潛在前體[6～10]。蛋白消化程度會影響釋放出的功能多肽[11]，乳蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化能力根據(jù)多肽的大小和特定的氨基酸序列而有所不同[12]。

目前國內(nèi)關(guān)于水牛乳酪蛋白基因多態(tài)性的研究較少。本試驗通過分析β-CN基因多態(tài)性對消化性能和抗氧化性能的影響，尋找中國常見品種水牛乳β-CN的優(yōu)勢等位基因，以期為功能性乳制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水牛乳中β-CN基因多態(tài)性分析及純化

收集中國農(nóng)科院廣西水牛所牧場內(nèi)160頭泌乳中期、6胎以內(nèi)的水牛（包括摩拉46頭、尼里26頭、雜交品種88頭）乳樣。采用安捷倫1260型液相色譜儀，根據(jù)Bonfatti等的方法對β-CN基因型進(jìn)行判定，并采用DEAE Bestarose Fast Flow陰離子交換色譜柱，使用GE AKTA Pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)對β-CN基因型為AA、BB及AB的水牛乳樣進(jìn)行分離純化[13,14]。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對其進(jìn)行分析，確定蛋白類型及純度。使用1-Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)配合截流量為10ku的Pellicon XL超過濾膜對過0.22μm濾膜的收集液進(jìn)行脫鹽處理。

1.2 消化性能測定

消化性能測定參考Lisson等的方法[15]。將AA、AB和BB三種基因型的β-酪蛋白溶解在模擬胃液配成20mg/mL的消化液。加入胃蛋白酶(2000U/mg蛋白)后放入37℃恒溫水浴振蕩器。分別在消化的0min(胃0)、15min(胃15)、30min(胃30)和60min(胃60)四個時間點取出在沸水加熱滅酶。60min后加入等體積的模擬腸液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加入胰蛋白酶(120U/mg蛋白)繼續(xù)在37℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化。在消化的0min(胰0)、30min(胰30)、60min(胰60)和120min(胰120)四個時間點取出在沸水加熱滅酶。將8個時間點取出的消化液調(diào)節(jié)pH值至7.0，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，比較三者的體外消化性能。

1.3 抗氧化性能測定

1.3.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力的測定參考Devendra等的方法并稍加修改[16]。取樣品溶液2mL和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，震蕩搖勻，室溫避光靜置30min，以無水乙醇為空白，于517nm處測定吸光值。吸光值越小代表清除DPPH能力越強(qiáng)。計算公式為：

式中，AS為樣品溶液對應(yīng)的吸光度值；Ab為超純水(0mg/mL)對應(yīng)的吸光度值。

1.3.2 對羥自由基清除能力測定

對羥自由基（·OH）清除能力的測定參考陳偉等的方法[17]。取樣品溶液0.5mL，9mmol/L的FeS04溶液0.5mL，8.8mmol/L過氧化氫0.5mL，搖勻靜置10min。隨后加入9mmol/L的水楊酸溶液0.5mL，搖勻37℃靜置30min，然后用多功能酶標(biāo)儀檢測510nm處的吸光值(Ai)。另取兩管做空白(AC)和樣品對照(Aj)，同樣條件下測定吸光值。計算公式為：

式中，Ai為提取液和水楊酸混合溶液的吸光值；Aj為提取液和空白溶液的吸光值；AC為水楊酸溶液與混合溶劑溶液的吸光值。

1.3.3 還原能力測定

還原能力的測定參考林燕和張艷萍等方法[18,19]。取樣品溶液0.25mL，加入PBS緩沖液B和K3Fe(CN)6(1%，w/v)各0.625mL，混勻后50℃水浴中反應(yīng)20min，用流水速冷后加入三氯乙酸(10%，w/v)0.625mL混勻，300g離心10min，取上清0.75mL加FeCl3(0.1%，w/v)0.1mL和0.5mL超純水搖勻，在700nm處檢驗溶液的吸光度。吸光度值越高，表明樣品還原能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上試驗過程中的數(shù)據(jù)結(jié)果采用SAS 9.2軟件的MIXDE程序單因素模型統(tǒng)計分析。所用模型如下：

式中，Y為所測指標(biāo)(DPPH自由基清率、對·OH自由基清除率、還原能力）；G為基因型固定效應(yīng)（i=1、2、3，分別代表AA、AB、BB基因型）；H為胎次效應(yīng)（j代表1～6胎）；e為隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛乳中β-CN基因多態(tài)性分析

本試驗檢測到水牛乳中β-CN的A和B兩種等位基因，發(fā)現(xiàn)了AA、AB和BB三種基因型，結(jié)果見表1。本試驗結(jié)果與Ramesha等[20]通過PCR-RFLP分析印度水牛β-CN基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)有兩種等位基因的研究結(jié)果一致。

表1 β-CN基因多態(tài)性與基因型統(tǒng)計結(jié)果

2.2 β-酪蛋白消化性能分析

模擬胃消化電泳圖見圖1，由圖可知樣品到胃液消化60min時，AB基因型消化比較完全，AA基因型的消化速率略快于BB基因型，但是兩種基因型的β-CN都沒有完全被消化。這與Petrat等通過對荷斯坦牛β-CN的不同基因型進(jìn)行模擬體外腸胃消化結(jié)果一致[21]。

圖1 胃液水解樣品SDS-PAGE結(jié)果

模擬腸消化電泳圖見圖2，由圖可以看出在體外腸消化60min之前，AA基因型就完全水解，到體外腸消化120min前，BB基因型也完全水解?？梢哉J(rèn)為A等位基因更利于水牛乳在腸道中消化。Dupont等發(fā)現(xiàn)在胃消化結(jié)束后β-CN完全消化，這與本試驗的AB基因型結(jié)果一致，但是該研究在60min的腸消化結(jié)束后仍有酪蛋白沒有被完全消化，這可能是腸消化時間較短造成的[22]。

圖2 腸液水解樣品SDS-PAGE結(jié)果

本試驗分離的β-CN三種基因型在經(jīng)過60min模擬體外胃消化以及120min模擬體外腸消化后均全部水解，其中AB基因型>AA基因型>BB基因型的消化率，BB基因型最難消化。這可能是基因突變導(dǎo)致蛋白的酶解位點和空間結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致了酶解的速率差異。

2.3 β-酪蛋白抗氧化性能分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

三種基因型的水解產(chǎn)物均具有一定的DPPH自由基清除能力，且在消化過程中有著相同的變化趨勢，均在胃60出現(xiàn)了最大值。在整個消化過程中，AA基因型的DPPH自由基清除能力一直高于BB和AB基因型，具體的差異性見圖3。在胃30～60這兩個時間段內(nèi)AA基因型的DPPH自由基清除能力顯著高于BB基因型（P<0.01），其余時間段兩者沒有顯著差異。綜上可知，AA基因型DPPH自由基清除能力優(yōu)于BB與AB基因型。

圖3 水解時間對DPPH自由基清除率的影響

2.3.2 對羥自由基清除能力分析

對·OH清除能力在腸消化階段急速增加，可以推測具有較強(qiáng)·OH清除能力的肽段是在胰蛋白酶的作用下被水解出來。由圖4的具體差異可知，在腸液消化階段三者都具有明顯的·OH清除能力，B等位基因的·OH清除能力均顯著強(qiáng)于A等位基因(P<0.05)。

圖4 水解時間對·OH清除率的影響

2.3.3 還原能力分析

三種β-CN基因型的還原性在胃60時達(dá)到最大值，可以認(rèn)為胃蛋白酶更有利于還原性多肽的釋放。整個消化過程中，BB基因型的還原性一直高于AA基因型型，兩者之間的具體差異見圖5。在胃30-胰30這個時間段三者有顯著的組間差異（P<0.05），可以認(rèn)為B等位基因的還原性要強(qiáng)于A等位基因。注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖5 水解時間對還原能力的影響

目前還沒有充足的研究證明，通過胃蛋白酶分解或者用乳酸發(fā)酵劑分解的酪蛋白可以產(chǎn)生具有強(qiáng)效抗氧化活性的肽[23]。但是α-CN的水解產(chǎn)物顯示出了抗氧化潛力、自由基清除活性、抑制酶和非酶脂質(zhì)的過氧化作用[24]。杜枘宣發(fā)現(xiàn)酪蛋白的DPPH清除率在模擬胃消化120min時達(dá)到了最大值46.4%，之后DPPH清除率開始下降[25]。這與本試驗發(fā)現(xiàn)DPPH清除率在胃消化階段逐漸增加一致，但是本試驗只模擬了β-CN在60min時胃液消化的情況，因而導(dǎo)致消化率不一致。Shanmugam等通過對比用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或多種酶組合消化酪蛋白釋放的多肽抗氧化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶-胰蛋白酶水解物的Trolox當(dāng)量抗氧化能力最高。胃蛋白酶-胰蛋白酶水解產(chǎn)物中分子量小于1KDa的多肽具有最高的抗氧化活性[26]。馬玲等研究不同菌種作用后干酪對羥自由基的清除試驗時發(fā)現(xiàn)，清除能力隨時間呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在成熟50d時，清除能力最強(qiáng)達(dá)到41.31%，這與本試驗發(fā)現(xiàn)β-CN的對羥自由基清除率先增后降的趨勢一致[27]。

綜上試驗結(jié)果可以得出，消化酶解有利于提高β-CN的抗氧化性能，后續(xù)在功能性乳制品研發(fā)過程中可以篩選B等位基因的原料乳開發(fā)相應(yīng)的高品質(zhì)乳品。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，160頭水牛乳中β-CN基因有A和B兩種等位基因。消化性能結(jié)果顯示A等位基因有利于β-CN在腸道的消化，抗氧化性結(jié)果顯示A等位基因的DPPH清除能力要優(yōu)于B等位基因，但在·OH自由基清除能力和還原性能力上B等位基因更有優(yōu)勢。β-CN基因多態(tài)性與體外消化功能和抗氧化活性的不同密切相關(guān)。后期可以依據(jù)本試驗結(jié)果以β-酪蛋白的A、B等位基因為標(biāo)記，為水牛業(yè)的定向育種以及精準(zhǔn)開發(fā)水牛乳功能性乳制品提供理論基礎(chǔ)。