李翔，張利芳

（江蘇省蘇州市第九人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200）

肺炎克雷伯菌（KP）是常見(jiàn)于人體呼吸道、消化道的革蘭陰性桿菌，也是醫(yī)院或社區(qū)獲得性感染的常見(jiàn)病原體［1?2］。碳青霉烯類抗菌藥物為治療KP的有效藥物，但臨床的不合理應(yīng)用使耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率逐年遞增［3］。本研究中探討了CRKP的耐藥方式，以提高碳青霉烯類抗菌藥物的臨床合理用藥水平?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：VITEK2?Compact型全自動(dòng)微生物分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司），配有藥物敏感性（簡(jiǎn)稱藥敏）試驗(yàn)卡片；抗菌藥物紙片（英國(guó)Oxoid公司）；ABI7500型基因擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；HYDRASYS型蛋白電泳分析儀，C?880V型CO2孵箱，均購(gòu)自美國(guó)Sebia公司；HC?2062型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；HulaMixer?Sample Mixe型渦旋混勻器（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

試藥：外排泵抑制劑PAβN（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為0001429016）；瓊脂糖（批號(hào)為D31018），引物（批號(hào)為B01019），均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mueller?Hinton瓊脂（MHA）藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基（青島日水生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為071123）；標(biāo)志物DL 2000（批號(hào)為A1901B），Ex Taq DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（批號(hào)為191148），均購(gòu)自北京基尼亞生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌蛋白抽提液（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)為2191785）；肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706（批號(hào)為491227），大腸埃希菌ATCC 25922（批號(hào)為561229），銅綠假單胞菌ATCC 27853（批號(hào)為550106），均購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；注射用美羅培南（日本住友商事株式會(huì)社，批號(hào)為201701023）；注射用亞胺培南（默沙東<中國(guó)>有限公司，批號(hào)為S012103）。

1.2 菌株來(lái)源

選取我院2017年1月至2020年12月收治的非重復(fù)性CRKP感染患者的耐藥菌株97株，分別編號(hào)為1?97號(hào)，均經(jīng)VITEK2?Compact型全自動(dòng)微生物分析儀分析確定對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

1.3 藥敏試驗(yàn)與細(xì)菌測(cè)定

采用VITEK2?Compact型全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分類，并對(duì)抗菌藥物的敏感性進(jìn)行初始檢測(cè)，操作步驟按儀器說(shuō)明書進(jìn)行。部分抗菌藥物無(wú)藥敏試驗(yàn)卡片，參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的《抗菌藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第27版信息增刊》（簡(jiǎn)稱《標(biāo)準(zhǔn)》）中Kirby?Bauer（K?B）法進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706、大腸埃希菌ATCC 25922與銅綠假單胞菌ATCC 27853［4］。

1.4 外排泵抑制試驗(yàn)

參考《標(biāo)準(zhǔn)》中瓊脂稀釋法測(cè)定分離菌的最低抑菌濃度（MIC），分別測(cè)定添加及未添加外排泵抑制劑PAβN（終質(zhì)量濃度為20 mg/L）的美羅培南和亞胺培南的MIC，兩者的測(cè)定質(zhì)量濃度均為0.06～128.00 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度均接種10 000 cfu細(xì)菌。與未添加外排泵抑制劑PAβN相比，添加后的MIC提高4倍以上，即為細(xì)菌有外排泵機(jī)制［5］。

1.5 碳青霉烯酶篩選試驗(yàn)

改良Hodge試驗(yàn)：參考《標(biāo)準(zhǔn)》，將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊闹聻a性大腸埃希菌ATCC 25922用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，均勻涂抹于瓊脂平板上，于中間位置貼放10 μg厄他培南紙片，接種環(huán)從紙片邊緣至平板外緣劃線接種待檢菌株，置35℃環(huán)境過(guò)夜培養(yǎng)。若次日厄他培南抑菌圈長(zhǎng)出矢狀生長(zhǎng)物，則視為待檢菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

Carba NP試驗(yàn)：取0.5%酚紅溶液2 mL，純水16.6 mL，10 mmol/L硫酸鋅溶液180 mL，置25～50 mL燒杯中，用10%鹽酸溶液或0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.7～7.9，作為A液；在A液中加入質(zhì)量濃度為6 mg/mL的亞胺培南溶液（無(wú)菌注射用水配制），作為B液。取2支微量離心管，分別標(biāo)記為a管和b管，均加入100μL細(xì)菌蛋白抽提液與1μL過(guò)夜培養(yǎng)的瓊脂平板接種環(huán)待測(cè)物，渦旋振蕩5 s，在a管中加入100μL A液，在b管中加入100 μL B液，渦旋，混勻，置35℃CO2孵箱中孵育2 h，每30 min查看并記錄顏色變化［6?7］。

1.6 PCR擴(kuò)增和序列分析

采用煮沸法提取與純化細(xì)菌基因組DNA，以此為模板，采用PCR法擴(kuò)增碳青霉烯酶［肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶（KPC）、AmpCβ?內(nèi)酰胺酶（AmpC）類、新德里金屬β?內(nèi)酰胺酶1（NDM?1）、超廣譜β?內(nèi)酰胺酶（ESBLs）類］基因，即分別為blaKPC、blaAmpC類和blaNDM?1、blaESBls類。以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司專業(yè)人員測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，并同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，以確認(rèn)擴(kuò)增的產(chǎn)物為靶基因片段及基因型［8］。

1.7 腸道細(xì)菌基因組重復(fù)序列（ERIC）-PCR同源性分析

引 物 序 列：ERIC1為5′?ATGTAAGCTCCT?GGGGATTCAC?3′，ERIC2為5′?AAGTAAGTGACT?GGGGTGAGCG?3′。擴(kuò)增條件：95℃下預(yù)變性7 min，94℃下變性1 min，45℃下退火1 min，65℃下延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；65℃下延伸16 min，1個(gè)循環(huán)；將擴(kuò)增的產(chǎn)物放入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓100 V，時(shí)間100 min，Tris硼酸電泳緩沖液（20倍稀釋）［9］。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)

共分離出97株CRKP，且對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均為100.00%；對(duì)氨基苷類、頭孢類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均超過(guò)85.00%；對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥率均低于25.00%。詳見(jiàn)圖1。

圖1 97株CRKP對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率Fig.1 Drug resistance rate of 97 CRKP strains to commonly used antibiotics in the clinic

2.2 碳青霉烯酶篩選試驗(yàn)

93株CRKP的改良Hodge試驗(yàn)和CarbaNP試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為95.88%；4株（編號(hào)分別為24，31，68，72號(hào)）CRKP的CarbaNP試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，而改良的Hodge試驗(yàn)結(jié)果為陰性；3株（編號(hào)分別為6，13，93號(hào)）CRKP的改良Hodge試驗(yàn)及CarbaNP試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

97株CRKP中，blaKPC的檢出率為89.69%（89/97），且均為blaKPC?2型酶；blaNDM?1的檢出率為71.13%（69/97）。blaESBLs類耐藥基因中，blaSHV，bla?TEM，blaCTX?M的檢出率分別為96.00%，77.00%，61.00%；blaAmpC類耐 藥基因中，blaDHA，blaFOX，blaCTT的檢出率分別為100.00%，87.00%，61.00%；未檢出blaAAC，blaEBC，blaGES，blaMOX，blaOXA?48，blaSME，blaVEB，blaVIM。blaKPC，blaNDM?1，blaTEM在CRKP耐藥基因中更具代表性［10］，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2。

M.Maker 1，4，7.陽(yáng)性菌珠2，5，8.陰性對(duì)照3，6，9.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D2 CRKP部分耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果M.Maker 1，4，7.Positive strains 2，5，8.Negative control 3，6，9 Positive controlFig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of partial drug resistance genes of CRKP

2.4 外排泵抑制試驗(yàn)

9株CRKP（編號(hào)分別為3，18，25，30，39，58，75，86，94號(hào)）有細(xì)菌外排泵機(jī)制，提示主動(dòng)外排泵參與了部分KP對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制，9株菌株耐藥基因的檢出率均大于85%。

2.5 ERIC-PCR基因分型

共發(fā)現(xiàn)9種類型的CRKP，參考文獻(xiàn)［11?12］，判斷各菌株的基因分型，其中1型42株，4型15株，5型14株，6型、8型各6株，2型、7型各4株，3型、9型各3株。部分耐藥菌株的ERIC?PCR基因分型見(jiàn)圖3。

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物在體內(nèi)外均對(duì)革蘭陰性桿菌有抑制作用，是臨床治療KP的首選藥物，但隨著應(yīng)用的增多，KP屬細(xì)菌對(duì)其耐藥的比例越來(lái)越高，部分治療多重耐藥KP感染有效的藥物（如亞胺培南、美羅培南等）已陸續(xù)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，且呈不斷上升趨勢(shì)［7］。

本研究中從非重復(fù)性CRKP感染患者體內(nèi)分離出97株CRKP，其在對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的同時(shí)，對(duì)氨基苷類等其他抗菌藥物亦有不同程度的耐藥。雖對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物耐藥率較低，但該類抗菌藥物毒副作用較大，長(zhǎng)期應(yīng)用可對(duì)患者的消化、泌尿、血液、中樞神經(jīng)等系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，并非為針對(duì)CRKP感染患者的首選藥物［13］。可見(jiàn)，CRKP作為一種高耐藥、高毒力的多重耐藥菌，其有效抗菌藥物的選擇范圍較窄。

CRKP最主要的耐藥機(jī)制為產(chǎn)生碳青霉烯酶［14］，水解青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類等抗菌藥物。碳青霉烯酶在國(guó)內(nèi)以KPC常見(jiàn)，也有耐亞胺培南（IPM）等。本研究中發(fā)現(xiàn)，CRKP感染患者存在多重耐藥基因積聚共存及外排泵抑制現(xiàn)象，與文獻(xiàn)［15?16］中提出的高產(chǎn)碳青霉烯酶（以KPC?2型酶為主），產(chǎn)AmpC酶伴外膜孔蛋白缺失或表達(dá)下調(diào)，主動(dòng)外排泵系統(tǒng)異常活躍等導(dǎo)致革蘭陰性菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的論點(diǎn)類似。

M.Maker 1，7.1型2，3，6，9，10，12.2型4，5.3型8.4型11.5型圖3 CRKP部分耐藥菌株ERIC-PCR基因分型電泳結(jié)果M.Maker 1，7.Type 1 2，3，6，9，10，12.Type 2 4，5.Type 3 8.Type 4 11.Type 5Fig.3 Electrophoretogram of genotypes of ERIC-PCR of partial drug resistance strains of CRKP

本研究中采用改良的Hodge試驗(yàn)與CarbaNP試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶表型，結(jié)果KPC?2型酶為CRKP產(chǎn)碳青霉烯酶的最主要亞型，這可能是導(dǎo)致CRKP對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。KPC?2型酶具有單獨(dú)致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥形成，而不依賴于外膜孔蛋白缺失的作用，加之其基因位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子上，經(jīng)可轉(zhuǎn)移的70 kb質(zhì)粒編碼，傳播高效［17］。ERIC?PCR同源性分析發(fā)現(xiàn)9種CRKP，其中1型為主要流行菌株，提示1型克隆株可能更易在本院流行傳播，醫(yī)務(wù)人員在嚴(yán)格規(guī)范使用抗菌藥物的基礎(chǔ)上，還應(yīng)加大醫(yī)院感染防控力度。