曾德貴，馮東輝

（1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳518020；2.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518107）

鳳尾蕨屬植物為傳統(tǒng)中藥材，目前已發(fā)現(xiàn)300余種該屬植物，我國約有66種，有24種可入藥［1］。半邊旗Pteris semipinnataL、劍葉鳳尾蕨Pteris ensiformisBurm、刺齒鳳尾蕨Pteris disparkze、蜈蚣草Pteris vittata和井欄邊草Pteris multifida是廣東地區(qū)常見的鳳尾蕨屬植物，具有清熱利濕、利尿、消食、殺蟲等功效，民間常用于治療疳瘡、濕疹、蛇蟲咬傷等［2］。半邊旗的水提物和醇提物抗腫瘤作用好，且無明顯毒性［3］，其作為民間常用中草藥被收載為廣東地區(qū)地方習(xí)用藥材標準品種，其余4種藥用植物的抗腫瘤研究在國內(nèi)外均少見報道。為了充分利用廣東地區(qū)的中草藥資源，本研究中探討了這5種藥物對人早幼粒白血病HL?60細胞株（簡稱HL?60細胞）和人慢性髓樣白血病K562細胞株（簡稱K562細胞）的生長抑制作用，以開發(fā)新的抗白血病藥物?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：371型CO2孵箱、ST 40R型超速離心機（美國Thermo Fisher公司）；ME104E型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.001 g）；Malab WT100?2型水浴箱（杭州米歐儀器有限公司）；索氏提取器（北玻股份有限公司，規(guī)格為50 mL）；37XB型倒置生物顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）。

試藥：半邊旗、劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草均采自廣東湛江湖光巖地區(qū)，井欄邊草采自廣東省廣州市郊，經(jīng)廣東省中藥研究所曾慶錢主任中藥師鑒定均為正品；RPMI?1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號為1737734）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號為20190202）；甲醇、乙醇、二甲基亞砜均為分析純。

細胞：HL?60細胞（上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）；K562細胞（廣州市腫瘤研究所）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)：將HL?60細胞和K562細胞置含10%滅活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI?1640完全培養(yǎng)基中，置溫度為37℃、飽和相對濕度為0.05%的CO2孵箱中培養(yǎng)。在細胞數(shù)達1×109個/L前用完全培養(yǎng)基重新懸浮，并以1∶3細胞數(shù)的比例傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)試驗。

供試品溶液制備：取半邊旗、劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草、井欄邊草各2 g，剪碎，過80目篩，制成粗粉，分別置索氏提取器中，加入95%乙醇適量，回流提取6 h，提取液用甲醇定容至50 mL容量瓶中；并以6 000 r/min的速率離心15 min，分別準確量取10 mL，50℃水浴至甲醇蒸干，加入二甲基亞砜，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0 g/L的系列供試品溶液。

細胞生長抑制試驗：取對數(shù)生長期的HL?60細胞和K562細胞，用完全培養(yǎng)基稀釋至（1.0～2.0）×108個/L，分別裝入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，每孔細胞分別加入1 μL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，另吸取1μL二甲基亞砜作為對照（供試品質(zhì)量濃度為0 g/L），做3～6個平行孔，將細胞置溫度為37℃、飽和相對濕度為0.05%的CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，分別取出，用臺盼藍染色，3 min內(nèi)用計數(shù)板統(tǒng)計活細胞數(shù)和死細胞數(shù)，采用37XB型倒置生物顯微鏡觀察，死細胞顯淡藍色；活細胞拒染，顏色無明顯變化。以公式［細胞存活率（%）=活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%］計算細胞活存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對K562細胞生長的抑制

由表1可知，5種鳳尾蕨屬植物對K562細胞的生長均有抑制作用；半邊旗對K562細胞生長的抑制作用最強，其次為蜈蚣草。

表1 5種鳳尾蕨屬植物對K562細胞生長的抑制作用比較Tab.1 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of K562 cells

2.2 對HL-60細胞生長的抑制

由表2可知，5種鳳尾蕨屬植物對HL?60細胞的生長均有抑制作用；半邊旗和刺齒鳳尾蕨對HL?60細胞生長的抑制作用較強，試驗濃度范圍內(nèi)兩者的作用差異不顯著，而劍葉鳳尾蕨和蜈蚣草的抑制作用較弱。

表2 5種鳳尾蕨屬植物對HL-60細胞生長的抑制作用比較Tab.2 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of HL-60 cells

3 討論

半邊旗中二萜類有效成分pteisolic acid G（PAG）可提高Bax/Bcl?2基因和蛋白質(zhì)的比值，從而誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡［4］；5F（11α?羥基?15?氧?16?烯?貝殼杉烷?19?酸）可有效減少酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠血清中一氧化氮、腫瘤壞死因子?α、白細胞介素6、白細胞介素10、單核細胞趨化蛋白1的含量，從而減輕炎性反應(yīng)［5］。半邊旗主要通過抑制腫瘤細胞的DNA與RNA和蛋白質(zhì)合成［6?7］，阻斷腫瘤細胞的細胞周期［8］，起到殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長的作用。

藥用植物親緣學(xué)研究結(jié)果表明，親緣關(guān)系近的植物含有結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)相似化學(xué)成分的生理活性多相似［9］，根據(jù)該原理從鳳尾蕨屬其他種類植物中尋找具有更強抗腫瘤活性的對映貝殼杉烷型二萜類藥物。本研究結(jié)果表明，與半邊旗同屬的鳳尾蕨屬植物劍葉鳳尾蕨、刺齒鳳尾蕨、蜈蚣草和井欄邊草也具有抗白血病作用，但半邊旗和刺齒鳳尾蕨對HL?60細胞的抑制作用較強，4.0 g/L半邊旗和刺齒鳳尾蕨乙醇提取物中，HL?60細胞的存活率均為0；半邊旗和蜈蚣草對K562細胞的抑制作用較強，4.0 g/L半邊旗和蜈蚣草乙醇提取物中，K562細胞的存活率分別為0和7.70%。

綜上所述，5種鳳尾蕨屬植物均可抑制HL?60細胞和K562細胞的生長，但對HL?60細胞的生長抑制作用強于K562細胞；除半邊旗外，刺齒鳳尾蕨和蜈蚣草可能是潛在的抗白血病藥物。