許海燕，王 珊，彭修娟，陳衍斌，侯敏娜，劉艷紅，逯 莉，劉 峰，△

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712046；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075）

腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的第二類(lèi)原因，與缺血性心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成多數(shù)國(guó)家的三大致死疾?。??2］。龍生蛭膠囊由黃芪、水蛭、桃仁、紅花、川芎等12味中藥材組方，具有補(bǔ)氣活血、逐瘀通絡(luò)功效，臨床用于治療氣虛血瘀型中風(fēng)［3］。方中桃仁味苦、甘，性平，活血化瘀，潤(rùn)腸通便［4］；紅花味辛，性溫，活血通經(jīng)，祛瘀止痛［5］；川芎味辛，性溫，活血行氣，祛風(fēng)止痛［6］。桃仁破血力強(qiáng)，紅花行血力盛，川芎相須為用，共為臣藥行氣化瘀，三藥配伍，共奏活血破瘀之功，具有活血而不傷血、補(bǔ)血而不留瘀的特點(diǎn)，可祛瘀生新［7］。本研究中基于中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0（TCMIP V2.0）［8］預(yù)測(cè)了龍生蛭膠囊中臣藥桃仁?紅花?川芎藥組治療腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥組化學(xué)成分來(lái)源

在TCMIP V2.0“中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)”項(xiàng)下分別以“桃仁”“紅花”“川芎”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集其化學(xué)成分，建立“桃仁?紅花?川芎”藥組化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 藥組候選靶標(biāo)來(lái)源

在TCMIP V2.0“疾病數(shù)據(jù)庫(kù)”項(xiàng)下以“Stroke”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得與腦卒中相關(guān)的靶點(diǎn)。在“中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析”中，依次添加“桃仁”“紅花”“川芎”，對(duì)“桃仁?紅花?川芎”藥組化學(xué)成分庫(kù)中成分的靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇“相似性分?jǐn)?shù)≥0.8”的成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)，作為候選靶標(biāo)。TCMIP V2.0采用二維結(jié)構(gòu)（.mol或.sdf）進(jìn)行相似性比對(duì)，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法進(jìn)行相似性評(píng)分，并與美國(guó)食品藥物管理局（FDA）上市藥品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)［9］。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

TCMIP V2.0鑲 嵌 了HAPPI，Reactome，molecular interaction database（MINT），online predicted human inter?action database（OPHID），database of interacting proteins（DIP）等數(shù)據(jù)庫(kù)中的PPI數(shù)據(jù)，可直接獲得“桃仁?紅花?川芎”藥組的潛在靶標(biāo)與腦卒中疾病靶標(biāo)間的PPI［10］。

1.4 中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)基因功能挖掘分析

在TCMIP V2.0“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”項(xiàng)下建立“桃仁?紅花?川芎”藥組作用的潛在靶標(biāo)與腦卒中疾病靶標(biāo)間的PPI，通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度和節(jié)點(diǎn)緊密度，篩選核心節(jié)點(diǎn)基因，作為“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)中藥、化學(xué)成分、核心靶標(biāo)、通路、疾病間的關(guān)聯(lián)性，構(gòu)建中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)基因顯著參與的生物學(xué)反應(yīng)、所行使分子功能及其所在細(xì)胞內(nèi)定位。基于Drugbank，onlinemendelian inheritance in man（OMIM），human phenotype ontology（HPO），gene ontology（GO），therapeutic target database（TTD）及基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“桃仁?紅花?川芎”藥組的預(yù)測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析，利用Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)的Pathway信息，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)基因顯著參與的分子通路；利用ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病和表型數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)基因顯著相關(guān)的疾病和表型。最終構(gòu)建“中藥?活性成分?關(guān)鍵核心靶標(biāo)?通路”多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖［11?12］。

1.5 主要活性物質(zhì)與靶點(diǎn)的分子對(duì)接

采用Sybyl?X7.3軟件中的Surflex?Dock程序，將“桃仁?紅花?川芎”藥組主要活性物質(zhì)與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶2（ERK2）、Janus激酶2（JNK2）進(jìn)行對(duì)接，驗(yàn)證此藥組治療腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析結(jié)果共得到化學(xué)成分121種，包括桃仁3種，紅花46種，川芎72種，主要為有機(jī)酸、甾醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、糖苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、生物堿類(lèi)、酯類(lèi)等。為保證靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，設(shè)定桃仁、紅花、川芎中化學(xué)成分與FDA上市藥物間的相似性分?jǐn)?shù)≥0.8，得到三者的靶標(biāo)數(shù)目分別為90，426，358個(gè)。其中，上述3種藥材共有靶標(biāo)14個(gè)，包括一氧化氮合酶（NOS）及CSNK2A1，F(xiàn)abZ，NQO2，NR1I2，AKT1，NCOA1，NCOA2，ESR1，ESR2，GLTP，CBR1，SHBG，AHR。

基因功能分析和通路富集分析結(jié)果顯示，候選靶標(biāo)基因功能涉及氧化還原過(guò)程，離子傳輸、類(lèi)固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脂質(zhì)代謝過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程，心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參與心肌收縮、類(lèi)固醇代謝過(guò)程，化學(xué)突觸傳遞、鈣離子傳輸與導(dǎo)入等生物學(xué)過(guò)程。中藥候選靶標(biāo)通路富集分析結(jié)果顯示，涉及通路有核受體轉(zhuǎn)錄途徑、氨基丁酸（GABA）受體激活、葉酸代謝、膽汁酸和鹽的循環(huán)利用、胰島素分泌調(diào)節(jié)、突觸前去極化和鈣通道開(kāi)放、外源性物質(zhì)等通路。

2.2 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

共得到62個(gè)與腦卒中及藥物相關(guān)核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，其中27個(gè)靶標(biāo)與藥物相關(guān)，35個(gè)靶標(biāo)與疾病相關(guān)。利用PPI構(gòu)建核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1），平臺(tái)設(shè)定同時(shí)滿(mǎn)足大于節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度、節(jié)點(diǎn)緊密度的中位數(shù)為卡值。得到關(guān)鍵核心靶標(biāo)25個(gè)，包括HSP90AA1，AR，AKT1，CALM1，NFKB1，ESR1等；已知疾病靶標(biāo)11個(gè)，包括NR3C1，LIMK1，VHL，JAK2，HIF1A，APP，SMAD4，GTF2I，GTF2IRD1，F(xiàn)LNA，NOTCH3；藥物與疾病共有靶標(biāo)2個(gè)，包括NR3C1和APP。閆宇翔等［13］從基因整體層面研究發(fā)現(xiàn)，NR3C1與心血管疾病危險(xiǎn)因素間存在相關(guān)性。APP致病變體或重復(fù)會(huì)導(dǎo)致腦淀粉樣血管病的發(fā)生，引發(fā)原發(fā)性非創(chuàng)傷性腦出血。HSP90AA1與抑郁癥有關(guān)［14］，可通過(guò)調(diào)節(jié)HSP90AA1的表達(dá)水平來(lái)抑制腦卒中后抑郁。AKT1能介導(dǎo)心血管疾病，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）分泌，并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化過(guò)程［15］。因此，AKT1可能在許多心血管疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖1 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of key targets

2.3 藥組治療腦卒中基因功能及通路信息分析

“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)基因功能見(jiàn)表1。通過(guò)關(guān)鍵靶標(biāo)功能信息可以推測(cè)，“桃仁?紅花?川芎”藥組主要通過(guò)調(diào)節(jié)NOS活性的正向調(diào)控、一氧化氮（NO）生物合成過(guò)程的正向調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、凋亡過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控治療腦卒中。NOS可調(diào)節(jié)NO的生成，而NO是腦血管系統(tǒng)中重要的保護(hù)因子［16］，在缺血再灌注損傷過(guò)程中起重要作用［17］。

表1 “桃仁-紅花-川芎”藥組治療腦卒中的靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)基因功能列表Tab.1 List of targets and disease target gene functions of″Persicae Semen-Carthami Flos-Chuanxiong Rhizoma″drug group in the treatment of stroke

“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的分子通路（見(jiàn)表2）主要涉及核受體轉(zhuǎn)錄途徑、四氫生物蝶呤（BH4）的合成回收和調(diào)控、內(nèi)皮型eNOS激活、細(xì)胞內(nèi)受體的SUMO化、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）介導(dǎo)的血管通透性等條目。如通過(guò)BH4的合成、回收及調(diào)控，增加eNOS的活性，抑制缺血再灌注引起的損傷［18］。缺血性腦損傷的發(fā)生與SUMO化有關(guān)［19?20］；VEGFR?2可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活和通透性，促進(jìn)腦組織缺血區(qū)域再灌注［21］。

表2 “桃仁-紅花-川芎”藥組治療腦卒中的分子通路列表Tab.2 List of molecular pathways of″Persicae Semen-Carthami Flos-Chuanxiong Rhizoma″drug group in the treatment of stroke

上述靶標(biāo)功能和分子通路多數(shù)與神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)有關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能的表達(dá)異常，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能異常［22］，從而導(dǎo)致腦卒中發(fā)生。

2.4 網(wǎng)絡(luò)可視化圖分析

運(yùn)用整合藥理學(xué)平臺(tái)獲得了“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的核心靶標(biāo)，推測(cè)“桃仁?紅花?川芎”藥組可能通過(guò)作用于藥物與疾病共有靶標(biāo)而發(fā)揮對(duì)腦卒中的干預(yù)作用，進(jìn)而發(fā)揮藥效，并利用核心靶標(biāo)及其與中藥成分和疾病間的關(guān)系繪制“中藥?活性成分?關(guān)鍵核心靶標(biāo)?通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖（見(jiàn)圖2）?？梢?jiàn)，“桃仁?紅花?川芎”藥組中可作用于腦卒中的活性成分共有19種，主要包括生物堿類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等，包括桃仁中的兒茶素，川芎中的川芎嗪、阿魏酸、香草醛、甾醇、川芎萜等，紅花中的紅花素、新紅花苷、亞麻酸、亞油酸等。參考文獻(xiàn)［23］，在腦卒中急性期治療的中醫(yī)用藥規(guī)律中，桃仁、紅花、川芎用藥頻次排在前10位，在腦卒中急性期及恢復(fù)期常用“紅花?川芎”藥對(duì)。證實(shí)該藥組治療腦卒中的可靠性及龍生蛭膠囊組方的合理性?；钚猿煞值难芯匡@示，“桃仁?紅花?川芎”藥組中的兒茶素可通過(guò)抑制白細(xì)胞的生成來(lái)預(yù)防血管炎癥，也可抑制血小板黏附及血栓形成，擴(kuò)張血管［24?25］。川芎嗪通過(guò)調(diào)節(jié)凝血、纖溶系統(tǒng)，調(diào)控血小板活化、神經(jīng)活性配體?受體相互作用等信號(hào)通路發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用［26］；川芎嗪、阿魏酸能保護(hù)腦卒中缺血后的急性損傷［27］。紅花素可通過(guò)抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，減少血小板聚集和黏附，發(fā)揮防治心血管疾病的作用［28］；何新康等［29］給予腦缺血再灌注模型大鼠腹腔注射不同劑量紅花素，結(jié)果顯示，紅花素對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。亞麻酸可通過(guò)增加缺血區(qū)局部的血流量，減輕腦組織缺血壞死的程度，提高腦缺血后的存活率［23，30］。

圖2 “中藥-活性成分-關(guān)鍵核心靶標(biāo)-通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Multi-dimensional network of″traditional Chinese medicine-active ingredients-key targets-pathways″

2.5 可能有效成分及調(diào)控靶點(diǎn)

從Protein Data Bank（PDB）［31］數(shù)據(jù)庫(kù)中下載ERK2和JNK2蛋白晶體結(jié)構(gòu)，分別提取2個(gè)靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的配體，暴露活性位點(diǎn)及除結(jié)晶水、加氫和除側(cè)鏈的殘基后；采用AMBER7 FF99力場(chǎng)能量?jī)?yōu)化；使用Surflex?Dock程序?qū)臃肿樱?2］，與篩選得到的“桃仁?紅花?川芎”藥組中主要活性成分進(jìn)行對(duì)接，得到化合物與核心靶點(diǎn)對(duì)接后的均方根偏差值（RMSD）。當(dāng)RMSD≤2.0?時(shí)［33］，說(shuō)明該對(duì)接方法能較好地重現(xiàn)出配體受體原來(lái)的結(jié)合模式，驗(yàn)證了對(duì)接參數(shù)設(shè)置的合理性。主要活性成分與靶蛋白的對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3?？芍疤胰?紅花?川芎”藥組中主要活性成分兒茶素、川芎嗪、阿魏酸、紅花素、亞麻酸與ERK2和JNK2均對(duì)接成功，推測(cè)“桃仁?紅花?川芎”藥組確有治療腦卒中的作用。對(duì)其活性成分進(jìn)行文獻(xiàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)出的活性分子，如兒茶素［24?25］、川芎嗪［26?27］、阿魏酸［27］、紅花素［28?29］、亞麻酸［23，30］等活性分子確屬治療腦卒中的有效物質(zhì)，驗(yàn)證了本研究方法的合理性與可靠性。

表3 主要活性成分與靶蛋白對(duì)接結(jié)果Tab.3 Docking results of main active ingredients and target proteins

3 討論

“桃仁?紅花?川芎”作為龍生蛭膠囊中的活血破瘀藥組，治療腦卒中療效顯著［34］。本研究中共預(yù)測(cè)得到活性成分19個(gè)，核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)62個(gè)，其中藥物靶標(biāo)27個(gè)，疾病靶標(biāo)35個(gè)，疾病與藥物共有靶標(biāo)2個(gè)；其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為生物堿類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等成分。采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行的虛擬篩選結(jié)果表明，“桃仁?紅花?川芎”藥組中的主要活性成分易與ERK2和JNK2形成較好的對(duì)接模式與較高的親和力，具有治療腦卒中的活性，也證實(shí)了TCMIP V2.0在預(yù)測(cè)中藥及復(fù)方作用機(jī)制方面的可靠性。

TCMIP V2.0數(shù)據(jù)源于ETCM中醫(yī)百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括中藥數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)、疾病相關(guān)分子庫(kù)等。設(shè)置了3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度、節(jié)點(diǎn)緊密度，以確定中藥矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)。通過(guò)基因功能分析和通路富集分析，確定靶標(biāo)基因的生物學(xué)功能及其所參與的生物學(xué)通路。本研究中借助TCMIP V2.0，以龍生蛭膠囊中的“桃仁?紅花?川芎”藥組為研究對(duì)象，初步闡明了此活血化瘀藥組治療腦卒中的作用機(jī)制，為龍生蛭膠囊的進(jìn)一步深入研究提供了理論及數(shù)據(jù)支持。但本研究結(jié)果是基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)所做的預(yù)測(cè)，還需通過(guò)進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。