徐向榮，姚雷

（1.煙臺大學(xué)校醫(yī)院，山東 煙臺264005；2.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺 264005）

新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS?CoV?2）導(dǎo)致，至今仍在全球肆虐。盡管緊急使用的多款疫苗對遏制疫情有一定作用，但病毒不斷變種，仍需開發(fā)新型小分子化合物藥物來預(yù)防和治療COVID?19。病毒感染主要涉及病毒吸附并穿入宿主細胞、病毒的復(fù)制及組裝、成熟病毒的釋放等階段，在上述階段采用藥物干預(yù)可有效控制病毒的感染和傳染。目前，抗冠狀病毒（CoV）小分子化合物藥物的開發(fā)策略主要有3種：一是通過虛擬篩選方式，從天然產(chǎn)物或合成化合物庫中篩選出對特定病毒靶點有潛在作用的化合物；二是對先導(dǎo)化合物進行結(jié)構(gòu)修飾改造，或從頭設(shè)計，發(fā)現(xiàn)活性較強且具有良好藥代動力學(xué)（簡稱藥動學(xué)）性質(zhì)的候選化合物；三是老藥新用，增加已上市藥物的適應(yīng)證。在此，采用計算機檢索SciFinder、PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中關(guān)于抗SARS?CoV?2小分子化合物的相關(guān)文獻，檢索時限為2019年1月至2021年3月，中英文關(guān)鍵詞為“COVID?19”“SARS?CoV?2”“small molecule”“新型冠狀病毒”，綜述了SARS?CoV?2感染各階段藥物的作用靶點及小分子抑制劑的研究進展，為加速新型抗病毒藥物的開發(fā)提供參考。

1 干擾病毒侵入

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）在SARS?CoV?2感染人體過程中扮演了關(guān)鍵角色［1］。SARS?CoV?2外殼上的刺突蛋白與ACE2結(jié)合后可進入人體細胞，引發(fā)肺炎，還可能會損傷肝功能及造成心肌損傷［2］。因此，通過與刺突蛋白或ACE2結(jié)合，進而阻斷病毒與ACE2的結(jié)合是預(yù)防和控制COVID?19的有效途徑［3］。

2020年初，中藥制劑在抗擊COVID?19疫情中發(fā)揮了重要作用。CHEN等［4］證實，中藥連花清瘟制劑中的連翹酯苷（1）、蘆薈大黃酸（2）、綠原酸（3）等多酚類物質(zhì)對ACE2具有強烈的抑制作用。LUO等［5］等報道，甘草酸（4）可通過抑制ACE2及下調(diào)促炎性細胞因子的表達而抑制病毒的吸附及穿入。CARINO等［6］和CHEN等［7］報道，白樺脂酸（5）、齊墩果酸（6）、五沒食子酰葡萄糖（7，PGG）等天然及半合成甾體類化合物可與刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)（RBD）結(jié)合，從而阻斷病毒與ACE2結(jié)合。SILVA ANTONIO等［8］通過虛擬篩選中藥天然產(chǎn)物及代謝物發(fā)現(xiàn)，黃芩苷（8）、柚皮素（9）、橙皮素（10）等11種黃酮類和二氫黃酮類物質(zhì)等有抑制ACE2的作用。同時發(fā)現(xiàn)，糖基化可增強苷元的活性，提取混合物的活性也顯著高于單一純物質(zhì)。鑒于此類天然產(chǎn)物毒副反應(yīng)較低，故有學(xué)者建議用于日常環(huán)境及防護器具的消殺。10種刺突/ACE2抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

除了從天然產(chǎn)物中尋找ACE2抑制劑外，CAO等［9］還利用計算機從頭設(shè)計了小分子蛋白LCB1和LCB3的氨基酸序列，分別為DKEWILQKIYEIMRLLDEL?GHAEASM RVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVER和NDDEL HMLMTDLVYEALHFAKDEEIKKRVFQLFE?LADKAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLS，其中LCB1的效力為迄今報道的最有效單抗的6倍，目前正在嚙齒動物中評估LCB1。

2 干擾病毒復(fù)制

SARS?CoV?2主蛋白酶（Mpro）又稱3C樣蛋白酶（3CLpro），是一種多聚蛋白裂解成病毒所必需的功能性蛋白酶。故通過抑制Mpro的活性，可抑制病毒的復(fù)制，從而達到抗病毒的目的。

1）合成肽類Mpro抑制劑

SARS?CoV?1和SARS?CoV?2的Mpro序 列相似性為96%，活性中心完全一致。HOFFMAN等［10］研究SARS?CoV?1的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，化合物11和化合物12（半數(shù)有效濃度為5μmol/L）的抗病毒作用均較好。其中的酮基團主要與病毒Mpro中的半胱氨酸?145形成四面體過渡態(tài)，2?吡咯烷酮基團與谷氨酸?166形成氫鍵。體內(nèi)試驗表明，化合物12的血漿穩(wěn)定性良好，清除率低，適于進一步開發(fā)成抗SARS?CoV?2藥物［11］。

QIAO等［12］根據(jù)治療丙型肝炎病毒感染的蛋白酶抑制劑波普瑞韋和替拉瑞韋的結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成了32個含有2?吡咯烷酮結(jié)構(gòu)的雙環(huán)脯氨酸衍生物，體外試驗證明，均可抑制病毒的復(fù)制［半數(shù)生長抑制濃度（GI50）為7.6～748.5 nmol/L］。其中，效果較好的化合物13和化合物14在SARS?CoV?2感染的轉(zhuǎn)基因模型小鼠中，可大大降低小鼠肺部的病毒載量，改善肺部病變程度，同時這2種抑制劑在大鼠體內(nèi)也表現(xiàn)出了良好的藥動學(xué)特性和安全性。分子對接試驗結(jié)果顯示，2?吡咯烷酮基團與病毒Mpro中的組氨酸?163和苯丙氨酸?140形成氫鍵作用，醛基與半胱氨酸?145作用。ZHANG等［11］設(shè)計合成了系列2?吡咯烷酮類化合物，作為CoV Mpro的廣譜抑制劑?；衔?5對重組CoV Mpro的抑制活性較好［半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.95μmol/L］。以環(huán)己烷代替化合物15中苯丙氨酸的苯環(huán)，得到化合物16，其在被病毒感染的Huh7細胞中也表現(xiàn)出了良好的抗中東呼吸綜合征（MERS?CoV）與抗SARS?CoV活性。進一步優(yōu)化化合物16的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，肉桂酰胺側(cè)鏈成環(huán)可得到含有吡啶酮的化合物17和化合物18，盡管抗病毒活性略降低，但化合物17和化合物18表現(xiàn)出了更好的吸收?分布?代謝?排泄（ADME）性質(zhì)。然而，去掉化合物18中的叔丁氧羰基保護基后，由于其產(chǎn)物無法透過細胞膜，故失去了抑制病毒復(fù)制的作用［13］。

FRECER等［14］通過建立三維定量構(gòu)效關(guān)系模型，優(yōu)化化合物18中的2?吡咯烷酮基團，發(fā)現(xiàn)引入2，4?咪唑二酮基團（化合物19和化合物21），可提高化合物的抗病毒作用。在P3和P1′部位引入含有雜原子的芳香環(huán)（化合物20和化合物21），增加了化合物與酶的氫鍵的結(jié)合能力，抗病毒活性也顯著提高。分子對接試驗結(jié)果顯示，化合物21比化合物18多了6個氫鍵（分別來源于乙內(nèi)酰脲、苯并噻嗪、甲酚基團）作用。

PANT等［15］報道了4種肽樣小分子病毒抑制劑，含有α，β?不飽和酯的化合物22和化合物24、酮基的化合物23和化合物25等，可與Mpro中的半胱氨酸?145、谷氨酸?166、谷氨酰胺?192等氨基酸殘基結(jié)合。

合成肽類Mpro抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。

2）具有抗SARS?CoV?2作用的化合物

TON等［16］篩選出了1 000余種潛在Mpro抑制劑，其中新型化合物585種?；钚暂^好的化合物均含有1?苯基?5?氨基吡唑結(jié)構(gòu)單元，如化合物26和化合物27。分子對接試驗結(jié)果顯示，化合物26中苯環(huán)與Mpro的P2部分產(chǎn)生疏水作用，哌啶酮基團則與半胱氨酸?145和亮氨酸?141形成2個氫鍵。

BUNG等［17］采用人工智能方法，針對Mpro靶點，從頭設(shè)計并篩選出了31個潛在抗CoV的新化學(xué)實體，其中預(yù)測活性最好的化合物28至化合物30均含有1個雙環(huán)或三環(huán)體系，同時含有酰胺等極性基團。

IBRAHIM等［18］報道了4種含有雙二氧戊環(huán)結(jié)構(gòu)的醛糖酸衍生物，即化合物31至化合物34，對Mpro親和性均較高（結(jié)合能>?56 kcal/mol，1 kcal=4.148 kJ）。其中，二氧戊環(huán)中的氧原子與Mpro中的組氨酸?163及甘氨酸?143氨基酸殘基形成氫鍵。由于含有磺酰胺結(jié)構(gòu)中的芳香雜環(huán)結(jié)構(gòu)可與Mpro中的谷氨酸?166殘基形成氫鍵，故化合物33和化合物34的活性高于化合物31和化合物32。理化性質(zhì)及類藥性預(yù)測結(jié)果均顯示，該類化合物可作為治療SARS?CoV?2的候選化合物。

虛擬篩選出的具有抗SARS?CoV?2作用的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

3）作用Mpro的天然產(chǎn)物

通過虛擬篩選及體外篩選，SAYED等［19］、BHARADWAJ等［20］、CHOUDHRY等［21］報道了多種天然黃酮類化合物，如2，3?二氫穗花杉雙黃酮（化合物35）、羅漢松雙黃酮B（化合物36）、蘆?。ɑ衔?7）、槲皮苷?3?O?α?L?吡喃阿拉伯糖苷（化合物38）、黃芩素（化合物39）、Penimethavone A（化合物40）、（+）?Anthraben?zoxocinone（化合物41），均可與Mpro結(jié)合，從而強烈抑制Mpro的活性。MHATRE等［22］報道了沒食子兒茶素沒食子酸酯（化合物42，EGCG）和茶黃素?3，3′?雙沒食子酸酯（化合物43，TF3）等茶多酚類物質(zhì)可與病毒復(fù)制過程中的多個靶點結(jié)合，可進一步開發(fā)成預(yù)防和治療CoV的藥物。

NOVAK等［23］通過虛擬篩選，從5 543個微生物天然產(chǎn)物圖集中發(fā)現(xiàn)8個化合物具有良好吸收?分布?代謝?排泄?毒性（ADMET）性質(zhì)如天然核苷Futalo?sine（化合物44）和吲哚生物堿類化合物（化合物45和化合物46），既可與Mpro的催化活性區(qū)結(jié)合而抑制酶的活性，又可和Mpro結(jié)構(gòu)中的Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)中間的溝槽結(jié)合，抑制酶的聚合及成熟。

作用于Mpro的天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 作用于Mpro的天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of natural products acting on MPRO

4）抑制病毒復(fù)制的化合物

SARS?CoV?2含有16個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP），其中NSP3，NSP9，NSP10，NSP12，NSP15，NSP16在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。PARIDA等［24］從印度的草藥中發(fā)現(xiàn)了9種天然產(chǎn)物，如醉茄素A（化合物47，Witha?ferin A）可選擇性地抑制病毒的NSP，達到抗病毒作用。MIRZA等［25］利用NSP12（RNA依賴性RNA聚合酶）及NSP13（解螺旋酶）的晶體結(jié)構(gòu)，虛擬篩選出了具有開發(fā)成廣譜抗病毒藥物潛力的先導(dǎo)化合物，如化合物48和化合物49均在NSP12的活性中心；采用和瑞德西韋一致的結(jié)合方式，與絲氨酸?759、賴氨酸?798、絲氨酸?814、天冬氨酸?623、精氨酸?553等殘基形成氫鍵。SARS?CoV?2的類木瓜蛋白酶（MLpro）在病毒的復(fù)制過程中與Mpro作用一致，MIRZA等［25］預(yù)測含有苯并噻唑結(jié)構(gòu)的化合物50可顯著抑制MLpro。體外試驗中，化合物50對Jurkat和MOTL?4細胞的IC50分別為9.67μmol/L和11.8μmol/L［26］。

SCHUMANN等［27］發(fā)現(xiàn)，5?氨基?2，3?二氫?1，4?二氮雜萘二酮（化合物51，MP1032）均具有多種藥理學(xué)作用，抑制SARS?CoV?2作用較強，1 mmol/L MP1032可抑制70%病毒的復(fù)制，2 mmol/L MP1032可100%抑制病毒的復(fù)制。在體內(nèi)的安全性方面，口服MP1032 3個月，未出現(xiàn)嚴重藥品不良反應(yīng)，但其抗病毒的分子機制仍需進一步確證。

抑制病毒復(fù)制的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖5 抑制病毒復(fù)制的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structures of compounds inhibiting virus replication

3 老藥新用

3.1 具有抗SARS-CoV-2作用的抗病毒藥物

目前，各國的醫(yī)藥學(xué)家通過篩選臨床研究各階段的藥物和候選化合物發(fā)現(xiàn)，部分藥物具有治療COVID?19的潛能［28?29］，包括抗病毒藥物可比司他（化合物52）、利托那韋（化合物53）、洛匹那韋（化合物54）、達蘆那韋（化合物55）、奈非那韋（化合物56）、沙奎那韋（化合物57）、替拉那韋（化合物58）、蘆平曲韋（化合物59）、茚地那韋（化合物60）、比卡格韋（化合物61）、埃替格韋（化合物62）和Tegobuvir（化合物63）。上述藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點見圖6。

圖6 具有抗SARS-CoV-2作用的抗病毒類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點Fig.6 Chemical structures，application and action targets of anti-viral drugs with anti-SARS-CoV-2 action

3.2 具有抗SARS-CoV-2作用的抗微生物類藥物

奧昔康唑（化合物64）、絲他康唑（化合物65）、酮康唑（化合物66）、艾沙康唑（化合物67）、伊曲康唑（化合物68）和普盧利沙星（化合物69）等抗真菌藥物和抗菌藥物具有抑制SARS?CoV?2 Mpro活性的作用。DU?ROJAIYE等［30］和ZHAO等［31］指出，頭孢呋辛酯（化合物70）和四環(huán)素（化合物71）等抗菌藥物可通過與病毒刺突RBD的酪氨酸與甘氨酸殘基作用，阻斷與ACE2結(jié)合；或與病毒復(fù)制組裝過程中的Mpro和NSP12等靶點結(jié)合，抑制病毒復(fù)制，從而發(fā)揮預(yù)防和治療COVID?19的作用。同時，2種藥物自身的抗菌及抗炎作用可明顯減少患者在重癥監(jiān)護病房的停留時間及呼吸機的使用時間。上述藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點見圖7。

圖7 具有抗SARS-CoV-2作用的抗微生物類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點Fig.7 Chemical structures，application and action targets of anti-microbial drugs with anti-SARS-CoV-2 action

3.3 具有抗SARS-CoV-2作用的精神類藥物

部分精神類藥物通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各靶點發(fā)揮藥理作用，也具有潛在抗SARS?CoV?2的作用。如作用于4?氨基丁酸（GABA）受體，用于治療失眠的佐匹克隆（化合物72）；作用于食欲素受體，用于睡眠障礙的萊博雷生（化合物73）；作用于5?羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等受體，用于治療精神、神經(jīng)疾病的藥物，如舍吲哚（化合物74）、匹莫齊特（化合物75）、氯噻平（化合物76）、度洛西?。ɑ衔?7）、瑞波西?。ɑ衔?8）、匹莫范色林（化合物79）、美噻噸（化合物80）、苯海索（化合物81）；作用于大麻素受體1，用于治療肥胖的藥物利莫那班（化合物82）；作用于酸敏感鉀離子通道的呼吸興奮劑多沙普侖（化合物83）；用于治療癲癇的谷氨酸鹽受體拮抗劑吡侖帕奈（化合物84）。上述藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點見圖8。

圖8 具有抗SARS-CoV-2作用的精神類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點Fig.8 Chemical structures，application and psychotropic of anti-psychotic drugs with anti-SARS-CoV-2 action

3.4 具有抗SARS-CoV-2作用的其他類藥物

組胺H1受體拮抗劑如依巴斯?。ɑ衔?5）、非索非那定（化合物86）、氯馬斯?。ɑ衔?7），以及M膽堿受體拮抗劑如哌侖西平（化合物88）、羥芐利明（化合物89），均具有潛在抗SARS?CoV?2作用。RIVA等［32］發(fā)現(xiàn)，激酶抑制劑阿匹莫德（化合物90）除可有效抑制埃博拉病毒、拉沙病毒、馬爾堡病毒外，還可抑制SARS?CoV?2病毒。用法用量為每次125 mg，每日2次，患者耐受性良好。ISGRO等［33］報道，利尿酸（化合物91）可有效且不可逆地抑制SARS?CoV?2 Mpro。分子對接試驗結(jié)果表明，利尿酸中的α，β?不飽和酮結(jié)構(gòu)可與Mpro活性部位中的半胱氨酸?145氨基酸殘基發(fā)生邁克爾反應(yīng)，形成共價鍵；羧酸基團可與酪氨酸?54形成氫鍵。但由于利尿酸的強利尿特性，在治療COVID?19時需嚴格控制，防止血栓等不良反應(yīng)發(fā)生。VATANSEVER等［34］發(fā)現(xiàn)，鉀離子通道開放劑芐普地爾（化合物92）可升高胞內(nèi)體pH，抑制病毒進入人體細胞，同時抑制Mpro的活性，干擾病毒復(fù)制。上述藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點見圖9。

圖9 具有抗SARS-CoV-2作用的其他類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式、用途及作用靶點Fig.9 Chemical structures，application and action targets of other drugs with anti-SARS-CoV-2 action

4 結(jié)語

目前，各種COVID?19疫苗包括滅活型及mRNA型疫苗開始在世界范圍內(nèi)使用。同時，各種病毒中和抗體及嵌合型病毒顆粒等新型疫苗也在緊張地研發(fā)中［35］。COVID?19疫苗的應(yīng)用大大降低了SARS?CoV?2的感染率，但對COVID?19感染患者尚無有效治療作用。雖然臨床應(yīng)急開發(fā)了植物藥單獨或與中西藥聯(lián)合治療，以及運用老藥新用的策略，但植物藥活性較低，有效成分及機制不明確，老藥不良反應(yīng)較多。此外，變異株病毒不斷出現(xiàn)，使疫情的控制更加困難。相對于大分子生物藥（疫苗）來說，抗CoV小分子藥物易于存儲，服用方便，成本低，且不良反應(yīng)少。因此，迫切需要作用機制明確、療效良好、針對SARS?CoV?2的特效小分子藥物。本研究中通過研究病毒結(jié)構(gòu)及復(fù)制組裝過程中的主要靶點，進一步揭示病毒變異規(guī)律，發(fā)現(xiàn)變異病毒及野生病毒復(fù)制共同作用的靶點。同時，利用現(xiàn)代化人工智能及計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)先導(dǎo)化合物優(yōu)化策略，可加速抗CoV小分子化合物藥物的研發(fā)。