金 鑫，余福勛，楊 麗，余本莉，崔玉霞，葉芝旭,△

(1.貴州省人民醫(yī)院眼科，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院中心實驗室/國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫疾病重點實驗室，貴州 貴陽550002；3.貴州省人民醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550002)

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界嬰幼兒和老年人病毒性呼吸道感染的主要原因，其每年造成的死亡人數超過流感。幾乎所有2歲以下兒童均感染過RSV。嚴重的RSV感染與兒童反復喘息及哮喘有關[1-2]。因此，RSV感染越來越受到重視，研究RSV致病機制、研發(fā)抗RSV藥物及疫苗均需進行RSV滴度定量測定。空斑形成試驗是測定病毒滴度的“金標準”，在國內外已得到廣泛應用。與甲基纖維素相比，瓊脂糖更容易覆蓋細胞單層[3-4]，但方法不當時，不易形成空斑。本研究應用瓊脂糖覆蓋細胞單層、中性甲醛固定及中性紅染色的試驗流程檢測病毒滴度，能形成合適的空斑，方法簡單且重復性較好，為進一步進行RSV相關基礎研究打下了基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料 人喉上皮癌細胞Hep-2及RSV A2標準株由重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸病研究室惠贈。胎牛血清購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM液體培養(yǎng)基和干粉培養(yǎng)基分別購自美國Gibco公司和Hyclone公司；Triton X-100、BSA、中性紅、胰酶和低熔點瓊脂糖購自北京Solarbio公司；鼠抗RSV N抗體購自英國ABCam公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗熒光二抗購自北京Bioss公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自上海碧云天公司。

1.2方法

1.2.1RSV感染細胞模型的建立 未感染RSV的Hep-2細胞作為空白對照組，感染RSV的Hep-2細胞作為試驗組，每組4個孔。Hep-2細胞按6×105/孔鋪板于12孔板中，待細胞單層生長至80%時，將感染復數為0.01的病毒液[用含2%胎牛血清(FBS)的DMEM稀釋病毒液]按每孔400 μL加入細胞中，于37 ℃、5% CO2條件下吸附2 h,每15～30分鐘搖動1次，以保證病毒分布均勻。吸附2 h后棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，以去除未被吸附的病毒。再次加入新的含2%FBS的DMEM每孔1 mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，顯微鏡下可觀察到明顯的細胞病變。收集標本，其中上清液用于測定病毒滴度，采用免疫熒光檢測方法檢測RSV N蛋白。

1.2.2細胞免疫熒光檢測 RSV感染Hep-2細胞后48 h，去除培養(yǎng)上清液，感染細胞用PBS洗滌3次，4%甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，再用含1%牛血清清蛋白(BSA)和0.3%Triton X-100的PBS封閉，同時打孔30 min。然后加入小鼠抗RSV N抗體(1∶200，1%BSA作稀釋液)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌細胞3次，再加入FITC標記的抗小鼠二抗(1∶300，1%BSA作稀釋液)，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌3次，加入DAPI染液常溫避光染色30 min，PBS洗滌3次，采用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡進行觀察和拍攝。

1.2.3簡易空斑試驗方法 Hep-2細胞以每孔3×105接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，達到100%融合時，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次。在冰盤上將病毒懸液以含2%FBS的DMEM作10倍系列稀釋，共8個稀釋度(10-8～10-1)。每一稀釋濃度設2個復孔，每孔分別接種200 μL病毒液，于37 ℃、5%CO2條件下吸附2 h,每15～30分鐘搖動1次，以保證病毒分布均勻，對照組僅加入含2%FBS的DMEM。吸附2 h后棄上清液，PBS洗滌2次，以去除未被吸附的病毒。加入瓊脂糖覆蓋層，瓊脂糖覆蓋層由1%低熔點瓊脂糖(瓊脂糖以滅菌注射用水配制，高壓滅菌處理，臨用前微波爐加熱融化，于42 ℃水浴保溫備用)及含5%FBS的2×DMEM(42 ℃保溫備用)按1∶1配制而成，使瓊脂糖濃度為0.5%，FBS濃度為2.5%，DMEM為1×DMEM。每孔加入上述瓊脂糖混合液1 mL，覆蓋細胞，室溫下靜置20 min后置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。觀察并記錄Hep-2細胞形成典型融合病變，即空斑的時間、形態(tài)及數量。培養(yǎng)5～6 d后，每孔加入1 mL10%甲醛固定細胞，1 h后小心去除瓊脂糖覆蓋層并用雙蒸水輕輕沖洗，每孔加入0.05%中性紅染液1 mL，常溫染色過夜，次日去除中性紅染液，自然晾干后肉眼計數空斑個數。將每孔記數為10～100的空斑數帶入計算公式，并按如下公式計算病毒滴度。病毒滴度=(每孔平均空斑個數×病毒稀釋度倒數)/每孔病毒接種量。

2 結 果

2.12組典型細胞病變情況 試驗組形成典型合胞病變，即感染細胞發(fā)生融合后形成多核巨細胞，直徑為1.5～2.5 mm，合胞形態(tài)不規(guī)則，細胞界限不清；空白對照組未見典型細胞病變。見圖1。

A為空白對照組，B為試驗組。

2.22組RSV N蛋白表達檢測結果比較 試驗組有綠色熒光表達，且可見細胞核聚集現象；空白對照組未檢測到非特異性的熒光標記。見圖2。

A為空白對照組，B為試驗組。

2.3RSV感染Hep-2細胞后形成的空斑 中性紅染色后，正常Hep-2細胞呈紅色，而RSV感染的Hep-2細胞不能染色，形成空斑。鏡下空斑形態(tài)與RSV形成的合胞病變一致(圖3A)?？瞻呷庋矍逦梢姡瑸轭悎A形或圓形，大小1.5～2.5 mm，邊緣不規(guī)則。隨著病毒稀釋度的增高，空斑數目逐漸較少(圖3B)。偶有部分細胞因去除瓊脂糖覆蓋層時不慎刮傷細胞，導致中性紅染色時亦不著色，但刮傷的細胞處肉眼可辨別出來，多成條索狀。計算2個復孔并取平均值，最后計算出病毒滴度為7.5×108PFU/mL。

A.鏡下空斑形態(tài)(400×);B.肉眼空斑，其中1～3未感染RSV，4～8病毒稀釋度為10-8～10-4。

3 討 論

RSV是導致全世界嬰幼兒病毒性肺炎最常見的病毒病原,可分為A、B兩種抗原亞型，其中RSV A2株是最常用于試驗研究的標準株[5]。研究RSV的致病機制、抗病毒藥物的篩選及新藥開發(fā)等均需要對病毒滴度進行測定。既往采用TCID50測定病毒滴度，但操作繁瑣、耗時且結果判斷有很大的主觀性[6]。病毒空斑試驗于1952年由Dulbecco首次描述用于檢測動物病毒，并在1954年用于檢測脊髓灰質炎病毒[7-8]。經過接近70年的不斷改進及優(yōu)化，病毒空斑試驗已是目前公認的測定病毒滴度的“金標準”[9-11]。在臨床前和臨床研究中，病毒空斑試驗是開發(fā)和評價新的抗病毒藥物或疫苗的重要工具。凡是感染后能使宿主細胞產生細胞病變效應的病毒都可以用空斑試驗檢測病毒滴度。采用空斑法可對呼腸孤病毒[11]、輪狀病毒[12-13]、新型冠狀病毒[14]、副流感病毒、RSV[3]等進行病毒滴度檢測。免疫法采用抗體標記RSV抗原蛋白，而后借助熒光顯微鏡計數空斑數，可將檢測時間縮短至3 d。但該方法需要使用較昂貴的抗RSV抗體及二抗，且需使用熒光顯微鏡，導致成本較高、操作繁瑣、重復性欠佳[9]。

本研究采用的簡易空斑試驗原理：RSV感染致密成片的Hep-2細胞后，然后覆蓋一層瓊脂糖半固體培養(yǎng)基，病毒感染細胞并在細胞中增殖，使細胞發(fā)生病變死亡。由于半固體介質的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周圍擴散，數天后可出現典型的細胞融合病變。去除瓊脂糖覆蓋層，細胞經甲醛固定后用中性紅染色，未被感染的細胞被染成紅色，而死細胞不能染色，因此出現肉眼可見的病毒空斑。理論上，當病毒液充分稀釋后，每一個空斑由1個感染性病毒顆粒繁殖并破壞細胞后形成，因此通過空斑數可精確測定病毒滴度[9]。RSV簡易空斑試驗通常在6～24孔板中進行，常用對RSV最易感的Hep-2細胞，易于形成典型的空斑。用來做培養(yǎng)基覆蓋的物質包括瓊脂糖、明膠、甲基纖維素等。常規(guī)RSV空斑試驗采用低熔點的瓊脂糖作為覆蓋層。既往采用3%固體瓊脂糖覆蓋后形成的空斑偏小，且需培養(yǎng)9～13 d后在顯微鏡下人工計數空斑[9]，固體瓊脂糖融化后易于凝固，操作時溫度難以把握，常因溫度過高導致細胞死亡，或溫度過低導致凝固，且非常耗時。近年來，采用0.6%或1%瓊脂糖[3,15]，即半固體瓊脂糖制作覆蓋層。瓊脂糖在較低溫度下不易凝固，形成空斑的時間可縮短至5～7 d，空斑更大，可肉眼觀察，操作簡單，可重復性強[3]。常用于空斑試驗的染料包括中性紅、結晶紫等。有研究比較了瓊脂糖-中性紅法及甲基纖維素-結晶紫法對嚴重急性呼吸綜合征病毒空斑檢測的影響，發(fā)現兩種方法測定到的病毒滴度無明顯差異[16]。瓊脂糖-中性紅法是最為常用的檢測各種病毒滴度的方法。細胞經甲醛固定后再用中性紅染色，只有活的細胞才能攝取中性紅，使細胞被染色，而死亡的細胞則不能染色形成空斑，且染色結果可長期保存[9]。

本研究中，RSV A2株感染Hep-2細胞后，顯微鏡下可形成典型的合胞病變，通過免疫熒光染色RSV N蛋白，可檢測到RSV N蛋白表達，提示RSV成功感染Hep-2細胞?？瞻咴囼炛校牍腆w瓊脂糖覆蓋細胞，經甲醛固定后并用中性紅染色，可見到形成合胞病變處的細胞不被染色形成空斑，而未感染的細胞被染成紅色，因而可直觀通過空斑個數計算病毒滴度。本試驗需要注意以下幾點：(1)空斑試驗所用的Hep-2細胞應處于最佳狀態(tài)，鋪板均勻，幾乎100%長滿培養(yǎng)板時，試驗結果最佳，應防止細胞生長過密或接種時細胞生長過久；(2)2×DMEM培養(yǎng)基配制后如放置時間過久，需注意pH值的變化，不適宜的pH值會導致細胞死亡；(3)瓊脂糖為低熔點瓊脂糖，且覆蓋時溫度適宜，覆蓋時動作要緩慢，防止氣泡產生，同時動作要快，防止混合物凝固及細胞因長時間脫離培養(yǎng)基或液體而死亡；(4)第1次做空斑試驗時，每隔12 h觀察1次細胞病變，了解細胞病變所需時間，避免觀察時間太晚導致細胞大量死亡。

綜上所述，基于瓊脂糖-中性紅法的簡易空斑試驗可直接觀察空斑計算病毒滴度，不需要進行免疫熒光染色和顯微鏡檢查，且檢測結果可無限期保存，具有試驗方法簡單、經濟等優(yōu)點。該方法可成功測定RSV病毒滴度，并可為后續(xù)RSV相關研究奠定基礎。