SUN Yong，王譯霄，宣曉婷，張熙悅，鄧文藝，靳歡，凌建剛

1.寧波諾丁漢大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，寧波 315100；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心/寧波市農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程重點實驗室，寧波 315400；3.湖南一品東方生物科技有限公司，長沙 410000

果汁是以水果為原料，經(jīng)壓榨、離心、萃取等物理方法得到原汁后再經(jīng)加工制成，其富含維生素、礦物質(zhì)、糖分和果膠等營養(yǎng)素[1-2]。根據(jù)不同的加工方式，可將果汁分為非濃縮還原型和濃縮還原型果汁，目前市場上大多數(shù)純果汁都是濃縮還原型果汁[3-5]。此外，相較部分發(fā)達(dá)國家，我國純果汁的市場份額占5%以下，因此，果汁市場具有巨大的發(fā)展?jié)摿εc前景。

受到西方飲食習(xí)慣以及健康理念的影響，在我國果汁產(chǎn)品逐漸受到人們喜愛。果汁行業(yè)較水果零售業(yè)具有更高的附加值，可以有效解決部分水果保鮮期短、運輸成本高等缺點。由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動，果汁摻雜、摻假等現(xiàn)象層出不窮[3,6]。這些摻假手段包括：兌水稀釋、添加外源糖、果渣以及其他果汁勾兌、使用低劣果汁摻假[7]。這些摻假手段除了使消費者的經(jīng)濟(jì)利益受損外，還可能對消費者造成嚴(yán)重的健康危害。因此，各國都在積極制定相應(yīng)的政策法規(guī)以完善果汁生產(chǎn)工藝和品質(zhì)控制。目前，果汁鑒偽技術(shù)主要有3個難點：一是水果種類的多樣性；二是地域性差異；三是不同儲存和處理技術(shù)的差異性等，導(dǎo)致果汁鑒偽的檢測流程長、手段復(fù)雜、費用高昂等問題[8]。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已有研究將代謝組學(xué)應(yīng)用于果汁鑒偽中，根據(jù)研究目的不同，可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，其中靶向標(biāo)記法是針對某個或某一組特定的靶向化合物進(jìn)行檢測，通常包括氨基酸、有機酸、寡糖、多糖以及單糖等[9]。該方法最大優(yōu)點在于能夠相對準(zhǔn)確和定量檢測出小分子代謝產(chǎn)物，為果汁鑒偽以及確定果汁產(chǎn)地提供可靠的參考依據(jù)[8,10]。而非靶向標(biāo)記法主要是通過檢測果汁內(nèi)的代謝產(chǎn)物的變化來鑒定真?zhèn)?，如以未摻假的果汁作為基?zhǔn)，摻假果汁中代謝成分的分解與轉(zhuǎn)化呈現(xiàn)不同趨勢，進(jìn)而實現(xiàn)鑒偽。

本文借助計算機機器學(xué)習(xí)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)爬蟲算法檢索文獻(xiàn)，總結(jié)近年來國內(nèi)外主要的果汁鑒偽技術(shù)的研究與應(yīng)用進(jìn)展，分析其優(yōu)勢和不足，并著重闡述基于代謝組學(xué)的非靶向/靶向標(biāo)記法在果汁鑒偽中的應(yīng)用，以期為果汁鑒偽技術(shù)研究提供參考。

1 網(wǎng)絡(luò)爬蟲算法與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

網(wǎng)絡(luò)爬蟲是模擬瀏覽器發(fā)送網(wǎng)絡(luò)請求，按照特定規(guī)則自動抓取互聯(lián)網(wǎng)信息的程序。利用爬蟲技術(shù)對文獻(xiàn)進(jìn)行抓取，可得到互聯(lián)網(wǎng)上所有公開學(xué)術(shù)文獻(xiàn)信息，并可批量下載。與傳統(tǒng)文獻(xiàn)檢索方式相比，使用爬蟲算法檢索可以節(jié)省文獻(xiàn)獲取時間，顯著提高工作效率。

本文主要對幾大主流數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(谷歌學(xué)術(shù) Google academic、Scopus、Springer、MDPI等)進(jìn)行收集，由于數(shù)據(jù)量巨大，我們使用了獨立研發(fā)的基于網(wǎng)絡(luò)爬蟲和數(shù)據(jù)分析算法的模型，該算法抓取數(shù)據(jù)、驗證數(shù)據(jù)的流程如圖1A所示。使用關(guān)鍵詞包括adulteration、authenticity、biomarker等。所有文獻(xiàn)都將通過自動和手動雙驗證以達(dá)到最大限度相關(guān)性。目前數(shù)據(jù)相關(guān)性可達(dá)90%以上[11-12]。根據(jù)文獻(xiàn)內(nèi)容，可分為五大類即農(nóng)業(yè)生物類(ABS)、化學(xué)類(CH)、工程類(EN)、生物化學(xué)類(BIO)以及醫(yī)藥類(Med)。由圖1B可見，2016年至今，有關(guān)果汁鑒偽的學(xué)術(shù)文章基本保持每年150篇左右。從學(xué)科分類上看，果汁鑒偽技術(shù)主要出現(xiàn)在農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)領(lǐng)域，每年的分布都在30%以上，與農(nóng)業(yè)食品安全有著緊密聯(lián)系。因此，果汁鑒偽與安全保障仍將是近年的研究熱點。

Med：醫(yī)學(xué)Medical;BIO：生物化學(xué)Biochemistry;EN：工程學(xué)Engineering;CH:化學(xué)Chemistry;ABS：農(nóng)業(yè)和生物科學(xué)Agricultural and biological sciences.

2 常用鑒偽方法

表1列舉了七大類不同的檢測方法。物理化學(xué)法是利用果汁中的特征組分來確定是否存在摻假，但存在一定局限性，如在加工過程中添加此類組分所導(dǎo)致的鑒偽精確度低，另外該方法也易受到品種、產(chǎn)地、成熟度及種植條件等因素的影響。光譜分析在果汁鑒偽中也有較多應(yīng)用，其具有檢測速度快、無損、測量方便和重復(fù)性佳等優(yōu)點。Vardin等[13]研究發(fā)現(xiàn)FTIR技術(shù)結(jié)合PCA分析可以鑒別石榴濃縮汁中摻假葡萄濃縮汁。León等[14]借助近紅外光譜檢測蘋果汁中摻糖情況，鑒偽度在91%～100%。核磁技術(shù)雖然需要較長的分析時間、樣品處理繁雜且成本高，但其通過18O/16O、2H/1H、13C/12C這些特征比率定量分析，所得的鑒偽精確度較高。此外，基于水果指紋DNA的檢測方法通常具有較好的特異性[14]，在進(jìn)行分析之前，需要對指紋DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用水果物理化學(xué)性質(zhì)的不同進(jìn)行鑒偽，但通常該方法的鑒偽度不高，一般可以達(dá)到25%。目前PCR技術(shù)已在蘋果汁、橙汁、梨汁等果汁鑒偽中進(jìn)行應(yīng)用。Morton等[15]借助PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳分析蘋果汁的特征基因圖譜，實現(xiàn)了蘋果汁的PCR鑒偽。同樣有研究報道成功從橙汁中鑒別柑橘汁，其變異系數(shù)僅為2.5%[16]。研究表明，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)具有靈敏度高、條件易優(yōu)化等優(yōu)點[17]，但其劣勢在于果汁樣品中DNA的含量較低，且加工方式會影響其含量，從而不利于PCR技術(shù)的應(yīng)用。綜上，每一種分析檢測方法都各有利弊，相應(yīng)的鑒偽度高低差別較大，未來將沿著不同檢測方法的耦合方向發(fā)展，為果汁鑒偽開發(fā)出更高效、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)和分析方法。

表1 果汁鑒偽主要方法 Table 1 Comparison of different detection methods

3 代謝組學(xué)在果汁鑒偽中的應(yīng)用

代謝組學(xué)作為現(xiàn)代食品科學(xué)研究的重要技術(shù)手段，在食品鑒偽中已逐漸開展應(yīng)用研究。利用核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、色譜(HPLC、GC)及聯(lián)用技術(shù)，對分子質(zhì)量<1 ku的代謝物進(jìn)行定量定性分析以達(dá)到物種鑒定的目的[27]。根據(jù)研究目的不同，代謝組學(xué)分為靶向代謝組學(xué)(靶向標(biāo)記法)和非靶向代謝組學(xué)(非靶向標(biāo)記法)。靶向標(biāo)記法是對特定代謝物進(jìn)行針對性、特異性的檢測與分析，而非靶向標(biāo)記法則是對有機體內(nèi)源性代謝物進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析。兩者有機結(jié)合可以更好地發(fā)現(xiàn)差異代謝物并進(jìn)行定量分析。

3.1 靶向標(biāo)記法

因水果種類、地域、品種和代謝途徑等不同，水果內(nèi)部的物理化學(xué)性質(zhì)也有所不同，使其呈現(xiàn)出獨特的性質(zhì)，從而賦予水果不同的特性。在果汁鑒偽過程中，精準(zhǔn)、快速地分辨其代謝成分的變化是至關(guān)重要的。靶向標(biāo)記法能夠?qū)瘜W(xué)成分進(jìn)行深入分析，是其中應(yīng)用最為廣泛的檢測方法之一。但是該方法的分析過程較為復(fù)雜，同時要求找到足夠的生物活性物質(zhì)作為標(biāo)記，這些不利因素也從不同程度上限制了其在品控和檢測上的大規(guī)模應(yīng)用。

表2總結(jié)了不同果汁中的生物活性物質(zhì)。從表2可以看出，不同果汁呈現(xiàn)出不同的生物標(biāo)記物，以2-甲基丙基-乙酸為例，其廣泛存在于蘋果汁中，但在其他類型的果汁中含量較低，可用于蘋果汁的鑒別。然而僅以2-甲基丙基-乙酸作為特征生物標(biāo)記物會影響準(zhǔn)確度。因此，增加生物標(biāo)記物的數(shù)量和種類可最大限度降低誤差，但也導(dǎo)致分析方法不可避免的復(fù)雜化，從而難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。因此，利用通用方法和特異性方法聯(lián)合鑒偽是未來發(fā)展趨勢。首先使用相對快速、經(jīng)濟(jì)的通用方法進(jìn)行初篩，之后再使用特異性方法對初篩樣品進(jìn)行針對性的特異性分析。

3.2 非靶向標(biāo)記法

非靶向標(biāo)記法是指采用 LC-MS、GC-MS、NMR技術(shù)，無偏向性地檢測受體體內(nèi)受到刺激或擾動前后所有小分子代謝物(分子質(zhì)量1 ku以內(nèi))的動態(tài)變化，并通過生物信息學(xué)分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進(jìn)行通路分析，揭示其變化的生理機制。相較于靶向標(biāo)記法，非靶向標(biāo)記法重在發(fā)現(xiàn)差異代謝物，可以定性及相對定量分析，操作簡便、成本較低。開發(fā)非靶向標(biāo)記方法是靶向標(biāo)記方法的重要補充。由于靶向標(biāo)記方法的諸多限制，開發(fā)更為有效和簡便的分析方法顯得尤為重要?，F(xiàn)代高分辨率質(zhì)譜以及分離技術(shù)如超高壓液相色譜等技術(shù)的發(fā)展，使非靶向標(biāo)記方法得以長足的發(fā)展。結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘以及多維化學(xué)計量分析技術(shù)，非靶向標(biāo)記方法可以更準(zhǔn)確而高效地分析果汁化學(xué)成分。Jandric 等[41]研究發(fā)現(xiàn)采用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)聯(lián)用技術(shù)可快速檢測果汁中摻雜低劣果汁。劉晗璐等[42]同樣利用UPLC-QTOF/MS技術(shù)實現(xiàn)了NFC和FC橙汁的區(qū)別，為NFC果汁的品質(zhì)鑒偽提供了新思路。

表3統(tǒng)計了非靶向標(biāo)記法在不同果汁鑒偽中的應(yīng)用。以花青素為例，由于花青素是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，在果汁加工和貯藏中，花青素將出現(xiàn)不同程度的代謝與降解[43-44]。如果出現(xiàn)人工摻雜，花青素含量也會出現(xiàn)異常水平，從而為鑒偽提供很好的標(biāo)記[45]。此外，非靶向標(biāo)記方法能夠找到果汁種類以及產(chǎn)地的相關(guān)性，因為不同產(chǎn)地的水果其所處生長環(huán)境不同，其代謝產(chǎn)物也呈現(xiàn)出細(xì)微的變化。除了主要代謝產(chǎn)物，水果中的次級代謝產(chǎn)物(醛、阿魏酸等)也可作為標(biāo)記物。實踐表明，使用非靶向標(biāo)記法所找到的標(biāo)記物與已知標(biāo)準(zhǔn)物聯(lián)合對果汁進(jìn)行鑒偽，通常準(zhǔn)確率都較高。由表3可見，在標(biāo)記物中，依據(jù)水果的種類、產(chǎn)地以及因呼吸作用引起的次級代謝，非靶向分析方法可以相對快速和準(zhǔn)確地確定不同果汁的指紋圖譜。與靶向標(biāo)記法相比，目前非靶向標(biāo)記法的研究也呈現(xiàn)逐步上升的趨勢。2020-2021年，從Scopus發(fā)表的論文數(shù)量上看，平均每年的發(fā)表數(shù)量在30篇(https://www.scopus.com/)。非靶向標(biāo)記方法因其分析過程相對快速和高效，正在逐步成為靶向標(biāo)記法的有力輔助手段。

表2 不同果汁中的生物標(biāo)記物 Table 2 Biomarkers in different fruit juices

表3 非靶向標(biāo)記法在不同果汁鑒偽中的應(yīng)用 Table 3 Application of non-targeted labeling method in the authentication of different fruit juice

此外，隨著現(xiàn)代高分辨率質(zhì)譜以及分離技術(shù)的快速發(fā)展，在果汁鑒偽中將產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，因而統(tǒng)計學(xué)方法顯得尤為重要。在眾多的統(tǒng)計分析方法中，ANOVA是在不同領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的數(shù)理統(tǒng)計方法，通過ANOVA分析，可以初步找到參量變化對于響應(yīng)結(jié)果是否具有統(tǒng)計顯著性[11]。偏最小二乘回歸(PLS)法通過投影預(yù)測變量和觀測變量得到一個新空間來建立一個線性回歸模型，目前在靶向和非靶向代謝組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用[52]?；诜窍嗨菩缘钠钚《嘶貧w(DPLS)是在偏最小二乘回歸的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的統(tǒng)計分析方法，其最大特點是能夠達(dá)到對主成分的回歸[53]。此外，主成分分析(PCA)作為一種統(tǒng)計分析、簡化數(shù)據(jù)集的方法而廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)處理[37]。俞邱豪[54]在小漿果類果汁鑒偽過程中，通過對果汁中化學(xué)成分進(jìn)行PCA分析得到32種特征標(biāo)記化合物可用于區(qū)別漿果類果汁。HCA和PCA最大的優(yōu)勢在于無監(jiān)督學(xué)習(xí)。這對于機器學(xué)習(xí)和數(shù)據(jù)挖掘具有非常重要的意義[12]。綜上所述，基于果汁樣品的自身復(fù)雜性，使用單一的統(tǒng)計數(shù)據(jù)方法往往會帶來較大誤差，目前通用的方法是聯(lián)合使用這些統(tǒng)計分析方法，從而避免單一統(tǒng)計方法帶來的系統(tǒng)性誤差。此外，隨著人工智能技術(shù)的不斷迭代，基于非監(jiān)督型的機器學(xué)習(xí)統(tǒng)計工具將可能成為未來全自動化果汁鑒偽技術(shù)開發(fā)的核心，這也對果汁鑒偽的整體算法建立和優(yōu)化提出了新的要求。隨著計算機算力和分析設(shè)備檢測限的不斷提高，全自動無人監(jiān)督的果汁鑒偽技術(shù)將成為未來的發(fā)展趨勢。

4 結(jié)論與展望

隨著社會和科技的快速發(fā)展，人們對綠色、健康、方便的理念越來越重視，在巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動下，果汁摻雜、摻假等問題嚴(yán)重，亟需高效、可靠、簡單的果汁鑒偽技術(shù)。相較于傳統(tǒng)鑒偽技術(shù)，代謝組學(xué)是針對生物代謝物對樣品進(jìn)行檢測，具有精確、可定量等優(yōu)勢，適合果汁等深加工產(chǎn)品的鑒偽。其中非靶向標(biāo)記法因其相對快速和高效的分析手法，正在逐步成為靶向標(biāo)記法的有力輔助，在果汁鑒偽領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大潛力?；诠瓨悠返漠a(chǎn)地、品種、加工和保存方式的多樣性、復(fù)雜性，使用單一的鑒偽技術(shù)往往會出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象，需要深入研究以加強代謝組學(xué)技術(shù)在復(fù)合果汁檢測中的適用性。此外，隨著數(shù)據(jù)挖掘和計算機技術(shù)的不斷更新迭代，基于非監(jiān)督型的機器學(xué)習(xí)統(tǒng)計工具如PCA、HCA等將可能成為未來智能化果汁鑒偽開發(fā)的核心。這也對果汁鑒偽技術(shù)整體算法的建立和優(yōu)化提出了新的要求。未來應(yīng)沿著不同檢測方法的耦合方向，為果汁鑒偽提供準(zhǔn)確率高的分析方法。

致 謝衷心感謝倫敦大學(xué)學(xué)院化學(xué)工程系劉奕楊教授協(xié)助算法編程與數(shù)據(jù)收集，感謝寧波諾丁漢大學(xué)英語語言教育中心楊善如教授協(xié)助論文撰寫，感謝寧波諾丁漢大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院何俊教授、中國科學(xué)院過程工程研究所王云山和楊剛教授對本文提出的寶貴修改意見。