李曼玲， 白曼莫， 吳海波

三亞市中醫(yī)院 骨科，海南 三亞 572000

骨肉瘤是一種多基因改變疾病，好發(fā)于兒童和青少年。骨肉瘤的惡性程度較高，容易發(fā)生轉移，臨床上約80%患者在確診時已經(jīng)發(fā)生轉移[1]。有研究顯示，轉移性骨肉瘤患者5年存活率僅10%～20%[1]。目前，臨床采用手術、新輔助化療等綜合方案治療骨肉瘤，極大提高了患者的5年存活率，但仍有27%接受化療患者3年內出現(xiàn)局部復發(fā)；另外，化療藥的不良反應較大，嚴重影響了患者的生活質量[2]。尋找新型、安全的治療藥物是臨床亟待解決的問題。人參皂苷Rg3(ginsenoside Rg3，G-Rg3)是人參中的主要活性成分，具有強大的藥理學活性，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護和抗腫瘤等作用[3]。有研究表明，G-Rg3可作用于腫瘤發(fā)生的不同環(huán)節(jié)，如增殖、侵襲、凋亡和自噬等，通過多種生物學機制發(fā)揮抗癌作用[4-5]。關于G-Rg3治療骨肉瘤療效的研究較少?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是生物有氧代謝的副產(chǎn)物，正常生理狀態(tài)下，ROS可以促進細胞的增殖和分化，但過量ROS可造成細胞氧化應激損傷。ROS可以激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族的重要成員之一，ROS/JNK通路可能是治療骨肉瘤的潛在靶點[6-7]。本研究通過分析G-Rg3對骨肉瘤細胞凋亡、自噬的影響，及其對ROS/JNK通路的作用，旨在為G-Rg3的應用提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 G-Rg3購于山東維奇生物科技有限公司；ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)、JNK特異性抑制劑SP600125均購自北京百奧萊博科技有限公司；PRMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗均購于上海語純生物科技有限公司；MTT檢測試劑盒、流式細胞分析試劑盒、LipofectionTM3000轉染試劑、EGFP-LC3質粒、BAX抗體、Bcl-2抗體、Beclin1抗體、P62抗體、p-JNK抗體和GAPDH內參抗體均購于生工生物工程(上海)股份有限公司； ROS檢測試劑盒購于上海齊源生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞(MG63)購于上海中科院細胞庫，將細胞培養(yǎng)于含1%青霉素鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。本研究所用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.3 G-Rg3對MG63細胞活力、凋亡和自噬的影響

1.3.1 MTT 檢測腫瘤細胞活力 96孔板中接種MG63細胞，每孔100 μl，加入不同劑量的G-Rg3(0、40、80、160 μmol/L)[8]，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每個培養(yǎng)孔加入MTT溶液50 μl，溫室孵育4 h，隨后吸出上清液，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，150 μl。用酶標儀在570 nm處檢測光密度值(optical density，OD)值。本研究重復4次。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 將MG63細胞以5×105個細胞密度接種于6孔板中，每孔加入2 ml無雙抗培養(yǎng)基，24 h后分別加入不同劑量的G-Rg3(0、40、80、160 μmol/L[8])，24 h后用胰酶消化收集細胞，加入400 μl結合液重懸細胞，隨后再加入5 μl Anexin V-FITC，4℃孵育15 min。用流式細胞儀和Flowjo V7軟件檢和分析測凋亡率。本研究重復4次。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬 將MG63細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，細胞貼壁后用LipofectionTM3000進行轉染。轉染前用Opti-MEM培養(yǎng)液將EGFP-LC3質粒(500 ng)和轉染試劑(5 μl)配置成對應的溶液，二者混勻后室溫放置15 min。隨后將混合液加入6孔板，37℃培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)液為含1%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后倒置激光共聚焦顯微鏡觀察LC3 puncta數(shù)目。

1.3.4 蛋白免疫印跡法檢測凋亡和自噬蛋白表達水平 RAPI裂解液提取細胞中的總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至PVDF膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入BAX抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、Beclin1抗體(1∶1 000)或P62抗體(1∶500)，4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗，封閉1 h。ECL發(fā)光儀進行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。本研究重復4次。

1.4 G-Rg3通過ROS/JNK通路誘導MG63細胞凋亡和自噬

將細胞分為對照組(CON)組，向細胞中加入等量培養(yǎng)液；G-Rg3組，向細胞中加入160 μmol/L G-Rg3；G-Rg3+NAC組，向細胞中同時加入160 μmol/L G-Rg3、ROS清除劑NAC；G-Rg3+SP600125組，同時加入160 μmol/L G-Rg3、JNK特異性抑制劑SP600125。

1.4.1 ROS檢測 細胞培養(yǎng)48 h后，用生理鹽水洗滌2次，隨后加入5 μmol/L二氫乙啶，4℃孵育15 min，用流式細胞術檢測細胞中ROS的產(chǎn)生，陽性細胞發(fā)射紅色熒光。細胞ROS水平用ROS陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)比值表示。本研究重復4次。

1.4.2 細胞凋亡和細胞自噬檢測 方法同1.3.2和1.3.3。

1.4.3 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平 方法同1.3.4。

2 結果

2.1 G-Rg3對MG63細胞活力的抑制作用 應用40、80、160 μmol/L的G-Rg3對MG63細胞進行干預，細胞活力均受到抑制，并且存在劑量依賴性(F=15.908，P<0.05)，其中,160 μmol/L的抑制效應最顯著(圖1)。

圖1 G-Rg3對MG63細胞活力的抑制作用

2.2 G-Rg3誘導MG63細胞發(fā)生凋亡和自噬 不同濃度的G-Rg3均可誘導MG63細胞發(fā)生凋亡(F=19.003，P<0.05)，使BAX蛋白表達水平升高(F=36.120，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平下降(F=40.002，P<0.05)，且存在劑量依賴性(圖2)。激光共聚焦顯微鏡觀察到不同濃度G-Rg3均可誘導MG63細胞發(fā)生自噬，LC3 puncta數(shù)目形成增加(F=21.542，P<0.05)，使Beclin1蛋白表達水平升高(F=18.334，P<0.05)，P62蛋白水平下降(F=17.281，P<0.05)，且存在劑量依賴性(圖3)。

圖2 不同濃度G-Rg3對MG63細胞凋亡的影響(a.流式細胞術檢測細胞凋亡；b.蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白表達)

圖3 不同濃度G-Rg3對MG63細胞自噬的影響[a.激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬(400倍)；b.蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白表達]

2.3 G-Rg3通過ROS/JNK通路誘導MG63細胞凋亡和自噬 G-Rg3(160 μmol/L)可以明顯誘導MG63細胞ROS的產(chǎn)生(P<0.05)和JNK的活化(P<0.05)，使細胞發(fā)生凋亡(P<0.05)和自噬(P<0.05)。NAC可以抵消G-Rg3誘導細胞凋亡(P=0.004)、自噬(P=0.009)、ROS(P<0.001)和JNK(P<0.001)活化的效應。在細胞中加入SP600125后，G-Rg3無法誘導細胞凋亡(P<0.001)、自噬(P<0.001)和JNK活化(P<0.001)，但是對ROS(P=0.201)產(chǎn)生無影響(圖4)。G-Rg3使MG63細胞BAX(P<0.001)和Beclin1(P=0.002)蛋白表達水平升高，使Bcl-2(P<0.001)和P62(P<0.001)蛋白水平降低。NAC可以抵消G-Rg3引起的BAX(P<0.001)和Beclin1(P=0.006)蛋白表達水平升高，抵消Bcl-2(P<0.001)和P62(P<0.001)蛋白水平降低。在細胞中加入SP600125后，G-Rg3無法引起B(yǎng)AX(P<0.001)和Beclin1水平升高(P<0.001)，Bcl-2(P=0.002)和P62(P=0.001)水平下降(圖5)。以上說明，G-Rg3誘導MG63細胞凋亡和自噬的信號通路為ROS/JNK途徑。

圖4 G-Rg3(160 μmol/L)通過ROS/JNK通路誘導MG63細胞凋亡和自噬[a.流式細胞術檢測ROS水平(與CON比值)；b.蛋白免疫印跡法檢測p-JNK蛋白表達水平；c.流式細胞術檢測細胞凋亡；d.免疫熒光觀察細胞自噬]

圖5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平

3 討論

骨肉瘤預后較差，尋找新的治療藥物勢在必行[9]。人參是傳統(tǒng)中藥材，其活性成分G-Rg3近年來備受關注。G-Rg3屬于人參二醇型四環(huán)三萜類皂苷，具有抗腫瘤活性，其機制可能為：誘導凋亡和抑制增殖、抑制上皮間質轉化、抑制腫瘤細胞干性、激活內質網(wǎng)應激、調節(jié)表觀遺傳修飾、促進DNA損傷修復、抑制糖酵解[10]。本研究通過體外研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度G-Rg3均能有效抑制骨肉瘤細胞MG63細胞活力，誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬，且存在劑量依賴性。類似的，既往研究亦發(fā)現(xiàn)，G-Rg3能抑制結直腸癌、乳腺癌、肝細胞癌等細胞增殖[11-13]。

ROS是細胞代謝的副產(chǎn)物，少量ROS可以促進細胞的增殖、分化，而過量的ROS可造成細胞氧化應激損傷[14]。有研究顯示，ROS可以激活下游MAPK信號通路，抑制細胞增殖[14]。JNK是MAPK信號通路的重要分支，在細胞氧化應激損傷和免疫炎癥損傷過程中起重要作用[15]。有研究表明，JNK激活能明顯誘導骨肉瘤細胞的凋亡和自噬，抑制增殖[16]。通過ROS/JNK信號通路可能開發(fā)出骨肉瘤的潛在治療藥物[17-19]。

本研究采用160 μmol/L G-Rg3進行后續(xù)機制研究。本研究結果顯示，ROS清除劑可以抵消G-Rg3誘導細胞凋亡、自噬、ROS和JNK活化效應。在細胞中加入JNK特異性抑制劑SP600125后，G-Rg3無法誘導細胞凋亡、自噬和JNK活化，但對ROS產(chǎn)生無影響。BAX和Bcl-2是細胞凋亡標志物，Beclin1和P62是細胞自噬標志物。NAC可以抵消G-Rg3引起的BAX和Beclin1蛋白表達水平升高，抵消Bcl-2和P62蛋白水平降低。在細胞中加入SP600125后，G-Rg3無法引起B(yǎng)AX和Beclin1水平升高，Bcl-2和P62水平下降。以上結果說明，G-Rg3誘導MG63細胞凋亡和自噬的信號通路為ROS/JNK途徑。

綜上所述，G-Rg3可能通過ROS/JNK通路誘導骨肉瘤MG63細胞發(fā)生凋亡和自噬。G-Rg3可能成為治療骨肉瘤的潛在藥物。本研究亦存在一定局限性，如本研究僅選擇了一種骨肉瘤細胞系進行研究；本研究僅進行了體外細胞研究，未在體內進行驗證。本研究未分析G-Rg3對骨肉瘤細胞周期的影響，有研究發(fā)現(xiàn)，G-Rg3可能通過ROS影響前列腺癌細胞周期，進而抑制細胞增殖[20]。G-Rg3對骨肉瘤細胞的作用機制需要未來深入分析。