張 沅， 張鵬博， 謝 歡， 韋 興， 李 楓， 劉 暢， 沈 寧， 王燕靖， 農(nóng)蔚霞， 張慶梅

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。近年來，盡管手術(shù)輔以放療和化療的傳統(tǒng)治療方法取得了較大進(jìn)展，但腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后并未得到明顯改善。因此，探究腦膠質(zhì)瘤的病理分子機(jī)制，為開展新的腦膠質(zhì)瘤輔助治療奠定基礎(chǔ)尤其重要。黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一擁有多個(gè)成員的大家族，因其許多成員在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在除睪丸和胎盤以外的正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，故被視為腫瘤分子靶向治療的理想靶點(diǎn)。MAGE-D4是2001年Sasaki等采用基因表達(dá)系列分析技術(shù)鑒定出的一個(gè)MAGE家族成員，起初命名為MAGE-E1，后來發(fā)現(xiàn)其基因組結(jié)構(gòu)及染色體定位與MAGE-D1非常相似，因此被歸入MAGE-D亞家族，并改名為MAGE-D4。研究顯示，MAGE-D4不表達(dá)或極低表達(dá)于正常腦組織，但高表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤，且沉默MAGE-D4表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，而過表達(dá)MAGE-D4則起到促進(jìn)作用。為進(jìn)一步了解MAGE-D4對腦膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，本課題組前期通過RNA-seq高通量測序發(fā)現(xiàn)沉默MAGE-D4表達(dá)可抑制肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白CORO1C的表達(dá)。鑒此，本研究旨在通過基因表達(dá)譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫、逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)一步探討MAGE-D4與CORO1C的關(guān)聯(lián)性及其臨床意義，為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療的靶點(diǎn)篩選提供參考。

1 資料與方法

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1

GEPIA數(shù)據(jù)庫資料GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個(gè)整合了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因型-組織表達(dá)(Genotype-Tissue Expression，GTEx)項(xiàng)目的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫。本研究采用單基因分析方法，輸入“MAGE-D4”或“CORO1C”后，選擇低級別腦膠質(zhì)瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)這兩種腦膠質(zhì)瘤類型，其中LGG 518例，GBM 163例。另選擇正常腦組織樣本數(shù)據(jù)207例作為對照。

1

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2

組織標(biāo)本和臨床資料 選擇2008年1月至2018年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切取的組織標(biāo)本73例，其中腦膠質(zhì)瘤62例，正常腦組織11例。腦膠質(zhì)瘤經(jīng)病理檢查確診?；颊咧心?5例，女27例，年齡2～78歲，中位年齡40歲；病理類型包括星形細(xì)胞瘤41例，GBM 12例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤5例和室管膜瘤4例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分級方法，Ⅰ～Ⅱ級(LGG)36例，Ⅲ～Ⅳ級(高級別腦膠質(zhì)瘤)26例。所有腦膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)前未接受放射和化學(xué)治療。正常腦組織來源于顱腦外傷行內(nèi)減壓手術(shù)患者。標(biāo)本離體后迅速置液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。以MAGE-D4和CORO1C mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。以上所有組織標(biāo)本的收集均經(jīng)患者知情同意，本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：20200040)。

1

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3

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 MG和U251購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。以DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、10%胎牛血清(Gibco公司)配制完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱(New Brunswick公司)條件設(shè)置為37 ℃，5% CO。

1.3.2 轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞以3×10cells/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，加入Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)與siRNA的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，孵育6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行干擾效率確認(rèn)及后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。siRNA由吉瑪基因股份有限公司合成，MAGE-D4特異性siRNA(MAGE-D4 siRNA)序列與陰性對照序列(不含MAGE-D4相關(guān)序列)見表1。

表1 siRNA序列

名 稱序列(5'-3')MAGE-D4 siR-NASense:GUGCAAUCGGAAAGCUACATTAntisense:UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC陰性對照Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTAntisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT

1

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4

RT-qPCR法檢測MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達(dá)水平 應(yīng)用細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒(Vazyme公司)提取組織標(biāo)本和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用超微量分光光度計(jì)(天根生化科技有限公司)檢測所提RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。確定RNA無降解后，應(yīng)用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒(Vazyme公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用LightCycler480II熒光定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行RT-qPCR，每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)體系：SYBR Green I Master 10 μl，ddHO 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，其序列見表2。以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算MAGE-D4和CORO1C的相對表達(dá)量。

表2 RT-qPCR引物序列

基因名上游序列下游序列MAGE-D45'-CCAGAATCAGAACCGAGA-3'5'-CCAAAATCTCCGTCCTCA-3'CORO1C 5'-TCCTCCCTCTGCACAAGACT-3'5'-GGATCTGCCATACCATGACC-3'GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

1

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5

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組

t

檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，以SNK檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[

n

(%)]表示，組間比較采用

χ

檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析探討MAGE-D4與CORO1C mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2

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1

腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達(dá)情況 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示，GBM、LGG組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達(dá)水平均高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖1。針對臨床樣本的RT-qPCR檢測結(jié)果也顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達(dá)水平高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，其表達(dá)水平分別是正常腦組織的3.038倍和3.713倍。見圖2。

經(jīng)單因素方差分析，*P<0.05

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織MAGE-D4和CORO1C mRNA表達(dá)水平比較圖

2

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2

MAGE-D4和CORO1C表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 MAGE-D4及CORO1C mRNA的表達(dá)水平與患者年齡、性別、WHO分級、病理類型、卡氏評分(Karnofsky performance score,KPS)、腫瘤最長徑，以及Ki-67、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、S-100和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)水平均無關(guān)聯(lián)性(

P

>0.05)。見表3，4。

表3 MAGE-D4表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[(%)]

組 別例數(shù)性別年齡(歲)WHO分級病理類型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ～Ⅳ級星型細(xì)胞瘤GBM少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤室管膜瘤高表達(dá)組3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)22(70.97)9(29.03)25(80.64)4(12.90)1(3.23) 1(3.23)低表達(dá)組3118(58.06)13(41.94)15(48.39)16(51.61)15(48.39)16(51.61)16(51.61)8(25.81)4(12.90)3(9.68)χ2-1.550.0653.2845.824P-0.7980.7990.0700.117組 別例數(shù)KPS(分)腫瘤最長徑(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)高表達(dá)組3114(45.16)17(54.84)12(38.71)19(61.29)14(56.00)11(44.00)21(84.00)4(16.00)19(95.00)1(5.00) 18(85.71)3(14.29)低表達(dá)組3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)10(43.48)13(56.52)24(88.89)3(11.11)20(86.96)3(13.04)22(100.00)0(0.00)χ2-0.5811.0420.751---P-0.4460.3070.3860.698*0.610*0.108*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指標(biāo)的檢查結(jié)果數(shù)據(jù)，不納入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作為低表達(dá)，(++)和(+++)作為高表達(dá)；為Fisher′s確切概率法所得值

表4 CORO1C表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[(%)]

組 別例數(shù)性別年齡(歲)WHO分級病理類型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ～Ⅳ級星型細(xì)胞瘤GBM少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤室管膜瘤高表達(dá)組3119(61.29)12(38.71)18(58.06)13(41.94)22(70.97)9(29.03)23(74.20)4(12.90)2(6.45)2(6.45)低表達(dá)組3116(51.61)15(48.39)13(41.94)18(58.06)15(48.39)16(51.61)18(58.06)8(25.81)3(9.68)2(6.45)χ2-0.5901.6133.2842.280P-0.4420.2040.0700.527*組 別例數(shù)KPS(分)腫瘤最長徑(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)高表達(dá)組3115(48.39)16(51.61)14(45.16)17(54.84)15(57.69)11(42.31)22(88.00)3(12.00)19(90.48)2(9.52)21(91.30)2(8.70)低表達(dá)組3116(51.61)15(48.39)14(45.16)17(54.84)9(40.91)13(59.09)23(85.19)4(14.81)20(90.91)2(9.09)19(95.00)1(5.00)χ2-0.0650.5811.3430.081--P-0.7990.4460.2470.7761.000*1.000*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指標(biāo)的檢查結(jié)果數(shù)據(jù)，不納入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作為低表達(dá)，(++)和(+++)作為高表達(dá)；為Fisher′s確切概率法所得值

2

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3

腦膠質(zhì)瘤組織MAGE-D4與CORO1C mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，臨床腦膠質(zhì)瘤樣本組織中MAGE-D4與CORO1C mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(

r

=0.848，

P

=0.000)。

2

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4

沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株MAGE-D4表達(dá)對CORO1C表達(dá)的影響 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)MAGE-D4 siRNA沉默后，U87 MG和U251細(xì)胞CORO1C mRNA的表達(dá)水平顯著下降(

P

<0.05)。見圖3。

圖3 沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株MAGE-D4表達(dá)后CORO1C的表達(dá)情況圖

3 討論

3

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1

目前臨床上對腦膠質(zhì)瘤的治療仍采用手術(shù)輔以放射和化學(xué)治療為主，但由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常組織無明確邊界，手術(shù)難以完全切除腫瘤。雖然殘余的腫瘤細(xì)胞可以通過術(shù)后放療和化療來清除，但由于血-腦屏障的阻隔、治療特異性及耐藥性等問題，其療效不佳。因此，腦膠質(zhì)瘤患者，尤其是惡性程度高的GBM患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率也較高。腫瘤分子靶向治療是其中一種正在發(fā)展中的新輔助治療方法，但開展腫瘤分子靶向治療需要篩選腫瘤特異性分子。

3

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2

MAGE家族是目前研究較深入的一類腫瘤相關(guān)抗原分子，其許多成員被認(rèn)為是腫瘤生物治療的理想靶抗原。目前其一些成員如MAGE-A1和MAGE-A3已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，在一些顱外腫瘤輔助治療中顯示出較好的療效。然而，由于腦膠質(zhì)瘤中MAGE-A等的表達(dá)率遠(yuǎn)低于非神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，這嚴(yán)重制約了MAGE-A等分子在腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療中的應(yīng)用。MAGE-D4是從GBM中鑒定出的一個(gè)MAGE成員，有研究顯示，MAGE-D4在許多腫瘤中特異性高表達(dá)。在本研究中，GEPIA數(shù)據(jù)庫分析及臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果均顯示MAGE-D4在腦膠質(zhì)瘤特異性高表達(dá)，這與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相似。此外，關(guān)于MAGE-D4的生物學(xué)功能，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，MAGE-D4的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為呈正關(guān)聯(lián)，這提示MAGE-D4屬于腦膠質(zhì)瘤特異性分子，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具有成為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療靶點(diǎn)的潛力。

3

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3

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多分子的參與及相互作用，為了尋找與MAGE-D4相互作用的分子，本研究團(tuán)隊(duì)前期對MAGE-D4沉默的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq高通量篩選，發(fā)現(xiàn)MAGE-D4沉默后下調(diào)的差異表達(dá)基因功能主要與肌動(dòng)蛋白、微絲和細(xì)胞骨架的結(jié)合相關(guān)，且MAGE-D4沉默后，CORO1C表達(dá)明顯下調(diào)。目前已知CORO1C是哺乳動(dòng)物七種冠蛋白中被報(bào)道與腫瘤關(guān)系最為密切的一種分子，其可與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合、交聯(lián)，以直接或間接的方式調(diào)控細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重塑，而細(xì)胞骨架的重塑與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲等惡性運(yùn)動(dòng)行為密切相關(guān)。目前已有文獻(xiàn)證實(shí)CORO1C在多種腫瘤中異常高表達(dá)，且與腫瘤的惡性表型和進(jìn)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示CORO1C在腦膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，與Thal等報(bào)道的結(jié)果相似。有研究顯示，CORO1C表達(dá)與彌漫性腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)，高級別腦膠質(zhì)瘤中CORO1C呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而LGG中CORO1C呈弱陽性表達(dá)。此外，CORO1C也可通過調(diào)控細(xì)胞骨架影響GBM的增殖、遷移、侵襲性偽足形成及基質(zhì)金屬蛋白酶分泌。以上結(jié)果提示CORO1C在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

3

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4

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4 mRNA和CORO1C mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，且經(jīng)沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株MAGE-D4的表達(dá)后，CORO1C表達(dá)也隨之下調(diào)，提示MAGE-D4與CORO1C之間存在相互作用，其可能共同影響了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。可能是研究病例數(shù)較少且臨床資料不夠完善的緣故，本研究未發(fā)現(xiàn)MAGE-D4和CORO1C的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)。這有待通過加大樣本量進(jìn)行前瞻性觀察研究以進(jìn)一步驗(yàn)證其二者與臨床病理及患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA均呈高表達(dá)，且二者表達(dá)水平呈正相關(guān)，其可能共同參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。但具體的分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，從蛋白相互作用和競爭性內(nèi)源RNA分子機(jī)制等方面展開研究。