王蘇亮，包曉琳，魏金龍，曲穎，曲延章

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液風(fēng)濕內(nèi)科四病區(qū)，黑龍江齊齊哈爾 161000

急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和慢性骨髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)屬于惡性腫瘤，目前的救治措施除了骨髓移植外，各種放化療治療方案并不具有十分有效的效果[1-2]。治療血液惡性腫瘤最常見且最困難的問題就是治療失敗，原因有很多，但最主要的是治療方法與藥物無法有殺死將癌細胞。許多研究都希望能解決或改善這種情形，以提高白血病的治愈率[3-4]。Ku蛋白質(zhì)能夠保護DNA雙鏈，調(diào)控細胞周期。Ku蛋白缺乏會產(chǎn)生多種腫瘤；Ku蛋白活性改變，能夠增強腫瘤放化療敏感性。但急慢性白血病的Ku蛋白表達以及與抗白血病治療之間的關(guān)系尚鮮見報道[5-7]。本研究選取2020年3月—2021年3月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院門診及住院治療的35例急性白血患者，對照組選取12名健康人，CML患者6例。分析35例急性白血病患者的臨床資料，探討Ku蛋白在AML、ALL與CML患者中的表達，并揭示Ku蛋白與白血病治療效果之間的關(guān)系，將對急慢性白血病的診斷及治療提供有利的實際應(yīng)用價值。采用有針對性的個性化治療方案，提高患者的生存質(zhì)量。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集35例急性白血病患者周邊血液與骨髓穿刺液，其中AML19例，成人17例，兒童2例；16例ALL，成人10例，兒童6例。另外，篩選BCR-ABL(+)CML患者6例。對照組為12名正常人的周邊血或骨髓穿刺液。所有參與項目的受試者采血和骨髓穿刺液都通過醫(yī)學(xué)倫理委員會的審議并獲得患者的知情同意。

1.2 細胞系收集

K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞購買自美國ATCC公司，本實驗室具有保存的細胞株。

1.3 方法

（1）將獲取的急慢性白血病患者外周血、骨髓穿刺液樣本，分別在入院時，利用實時定量PCR、流式細胞術(shù)鑒定Ku蛋白的基因表達；通過ELISA方法和Western blotting方法檢測急慢性白血病中Ku蛋白的表達定位以及表達含量情況。

（2）利用P65質(zhì)粒，向K562、HL-60、NB4細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Ku基因，利用流式細胞術(shù)、Western blotting、ELISA進行檢測轉(zhuǎn)染的Ku蛋白表達情況[8]。MTT實驗檢測轉(zhuǎn)染前后3種細胞的增殖變化情況；Western blotting、ELISA等實驗觀察轉(zhuǎn)染Ku基因前后的3種白血病細胞的凋亡、自噬等變化；細胞遷移實驗檢測急慢性白血病細胞的遷移變化。

（3）實時定量PCR的關(guān)鍵參數(shù)如下。

①Ku蛋白引物序列。正義：5’TGT CAG GGT GGG AGT CAT ATT AC；反義 ： 5’ TCG TTT TGC ACC TGG ATT ATC C。

②反應(yīng)條件。10×緩沖液3.0 μl，1.5 mM氯化鎂1.8 μl，0.25 mM dNTP 濃度 3.0 μl，0.2 μM 正義引物0.3 μl，0.2 μM反義引物0.3 μl，5 U/mL AmpliTag Gold 0.3 μl，dd H2O19.3 μl，cDNA2.0 μl。

③PCR條件。96℃，9 min（96℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min）×40 cycles；72℃,10 s；保持4℃。

（4）Western blotting：急性白血病患者周邊血液與骨髓穿刺液、6×105K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞，根據(jù)實驗設(shè)計原理和方法，添加不同環(huán)境和不同藥物或不容干擾條件，再將細胞培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)足夠合格的細胞中加入100 μl蛋白裂解液，完成細胞總蛋白的提取。每孔電泳槽中加入蛋白量約60 μg，250 mA電量轉(zhuǎn)膜2 h。PVDF膜置入TBS-T緩沖液中完成漂洗后，再封閉液中放入脫脂奶粉，室溫下振蕩1 h。PVDF膜放入1∶200稀釋的小鼠抗人Caspase 8、Ku、LC3蛋白抗體中，4℃過夜后，TBS-T液洗膜3次，添加1∶2 000稀釋羊抗小鼠IgG的HRP標記，ECL試劑混均后，完成實驗操作，觀察成像結(jié)果。

（5）Annexin V-FITC 細胞凋亡實驗：細胞凋亡試劑盒本實驗采用 Annexin V-FITC試劑盒完成檢測。將K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞5×105個，分別按要求種于6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h，根據(jù)本實驗設(shè)計好的分組情況，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集各個組的培養(yǎng)細胞，以0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞2 min，消化細胞和細胞上清液放入4℃箱內(nèi)，l 200 rpm，離心5 min后，再將上層的上清液去掉后，以100 μl PBS緩沖液充分混懸，然后加入 5 μl Annexin Ⅴ-FITC 與 2 μl碘丙啶（propidium iodine, PI），室溫避光靜置15 min后，加入400 μl PBS緩沖液后，即檢測細胞凋亡率（%）以FACSAria Ⅱ流式細胞分選儀完成。

（6）MTT細胞增殖實驗：在96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)1×104cells/well細胞。按照實驗分組情況，分別添加100 ng/mL米托司汀、2 μmol/L SB203580，在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)12 h后，加入10 mL, 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用Emax 50酶標儀，震蕩15 s，在490 nm波長檢測細胞增殖的吸光度值（OD值）。

2 結(jié)果

將收治的35例急性白血病患者，實驗分組比較結(jié)果。進行Western blotting分析Ku70，Ku80的表達，分析了AML和ALL的關(guān)聯(lián)性。正常對照組其中2名的Ku70與Ku80蛋白質(zhì)表現(xiàn)，量均低至無法偵測；但卻表現(xiàn)出另一約86 kDa大小的蛋白質(zhì)，見圖1。在AML與ALL檢查，Ku70與Ku80蛋白質(zhì)表現(xiàn)量上升情形，亦表現(xiàn)出另一約69 kDa大小的蛋白質(zhì)，見圖2、圖3。Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現(xiàn)情形及相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001、0.036、0.046），見圖 4、圖5、圖6。

圖1 Western blotting檢測正常對照組的Ku70和Ku 80

圖2 Western blotting檢測AML組的Ku70和Ku 80

圖3 Western blotting檢測ALL組的Ku70和Ku 80

圖4 急性白血病中Ku蛋白的相對表達

圖5 AML白血病中Ku蛋白的相對表達

圖6 ALL白血病中Ku蛋白的相對表達

3 討論

白血病為惡性腫瘤中的一種，而腫瘤是密切相關(guān)的一系列基因突變引起的健康機體內(nèi)細胞不能正常代謝，細胞的分化、生長和凋亡出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象而導(dǎo)致的疾病。多基因紊亂性疾病是由于一系列的基因改變導(dǎo)致不能控制細胞生長、細胞分化、細胞凋亡的多基因紊亂性疾病。DNA修復(fù)機制和端粒結(jié)構(gòu)維持機體基因組的穩(wěn)定在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面起重要作用，在染色體結(jié)構(gòu)中Ku蛋白扮演至關(guān)重要的作用，同樣Ku蛋白也維持端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此，以往學(xué)者認為Ku蛋白可能是一個腫瘤的抑癌基因[9-10]。此外，由于Ku蛋白在DNA修復(fù)中起到核心作用，腫瘤細胞自身也具備修復(fù)、分化、增生能力，對治療產(chǎn)生拮抗作用，增加治療難點。腫瘤的發(fā)生和進展與DNA修復(fù)和端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面存在密切關(guān)系，在維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中Ku蛋白起到關(guān)鍵性作用，故此研究者認為Ku蛋白可能為腫瘤抑制蛋白[11-12]。Ku蛋白質(zhì)為多功能蛋白質(zhì)，亦是多種基因家族的重要成員，近來有關(guān)于Ku蛋白質(zhì)與DNA形成的復(fù)合物與細胞株、癌癥相關(guān)性的報導(dǎo)，但是Ku蛋白與染色體、DNA等細胞結(jié)構(gòu)的關(guān)系與急慢性白血病發(fā)病機制的關(guān)系還不清楚，通過調(diào)控Ku蛋白活性而控制急慢性白血病診斷和治療，需進一步研究探索[13-14]。

研究顯示這種多發(fā)性骨髓瘤中Ku蛋白降低了與DNA末端的結(jié)合能力，不能結(jié)合和激活DNA，該項目結(jié)果還發(fā)現(xiàn)Ku蛋白自身活性降低，對放射線、博來霉素、絲裂霉素的敏感性較正常Ku86的多發(fā)性骨髓瘤或正常骨髓細胞高[15]。大量研究專家和學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過各種方法抑制Ku80蛋白和Ku70蛋白來增加腫瘤細胞敏感性，使腫瘤細胞放化療的特異性和靶向基因治療的效果得到提高[16]。Ku蛋白即為DNA修復(fù)蛋白，在修復(fù)DNA過程中發(fā)揮不可或缺的重要作用[17]，Ku蛋白活性減弱和缺失不足都與腫瘤進展關(guān)系十分密切；另外，腫瘤對放化療反應(yīng)機制中腫瘤細胞Ku蛋白活性的改變具有重要意義[18]。本研究通過Western blotting分析Ku70，Ku80的表達，分析了AML和ALL的關(guān)聯(lián)性。Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現(xiàn)情形及相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001、0.036、0.046）。陳沛帥等[19]Western Blot印跡法檢測Ku70、Ku80蛋白的表達，Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現(xiàn)情形及相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002、0.001、0.001）。本研究結(jié)果與陳沛帥的研究結(jié)論具有一致性，以此證實為延緩慢性白血病的發(fā)生、維護染色體結(jié)構(gòu)完整性、防治染色體損傷而提供科學(xué)依據(jù)，為防治阻止DNA突變提供切實可行的分子診斷手段；同時對擴展急慢性白血病的放化療治療方案，制訂個體化治療措施具有重要意義。最近幾年，隨著對白血病患病中Ku蛋白各種功能及其腫瘤作用機制的不斷研究，有理由相信高效地抑制白血病細胞中Ku蛋白的活性，可為個體化抗白血病治療的新靶點提供可靠證據(jù)。