黃達(dá)民，張金春，宋 蕾，岳冬梅，劉洪強(qiáng)，盧英民

動(dòng)脈粥樣硬化是促使心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)之一，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率逐年升高，研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及炎癥反應(yīng)與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[1-2]。因而，積極探尋調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的有效藥物對(duì)心腦血管疾病的治療具有重要意義。同型半胱氨酸(Hcy)可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，因此，常采用Hcy誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞建立模型[3]。紅參(red ginseng，RG)具有抗氧化作用，從而可減緩多種疾病的發(fā)展進(jìn)程[4]。但紅參對(duì)血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA DARS-AS1(LncRNA DARS-AS1)在甲狀腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[5]。但DARS-AS1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未闡明。生物信息學(xué)分析顯示，微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)可能是DARS-AS1的靶基因，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)靶向調(diào)控(NLRP3)的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖[6]。但紅參是否可通過(guò)調(diào)控DARS-AS1/miR-125a-5p通路而影響血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為尚未可知。因此，本研究采用Hcy處理人血管平滑肌細(xì)胞，探討紅參對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對(duì)DARS-AS1/miR-125a-5p通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 紅參購(gòu)自上海齊一生物公司；人血管平滑肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；Hcy與四唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；DARS-AS1小分子干擾RNA(DARS-AS1 siRNA，si-DARS-AS1)、siRNA陰性序列(si-NC)、miR-125a-5p mimics及mimic 陰性序列(miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物公司；pcDNA3.1購(gòu)自上?？吕咨锕荆煌每谷薈yclinD1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①紅參提取液[7]：稱量3 g紅參樣品，磨碎，加入20 mL水，超聲提取30 min，室溫條件下10 000 r/min離心10 min，收集3次提取液，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入培養(yǎng)基稀釋成濃度5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的溶液。②血管平滑肌細(xì)胞接種于6孔板(5×104個(gè)/孔)，分別加入含有500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h[8]，作為Hcy組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Control組。分別加入含有5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h，分別作為Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置Hcy+si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，加入含有濃度為500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h)、Hcy+si-DARS-AS1組(si-DARS-AS1轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，加入含有濃度為500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA組(pcDNA轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，加入含有濃度為20 mg/mL 紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1組(pcDNA-DARS-AS1轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，加入含有濃度為20 mg/mL 紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養(yǎng)基處理24 h)。

1.3 觀察指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 在96孔板上接種血管平滑肌細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)，按照MTT試劑盒說(shuō)明書操作并檢測(cè)細(xì)胞OD值。

1.3.2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲情況 在Transwell小室(美國(guó)Corning公司)下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液；Matrigel基質(zhì)膠包被(侵襲實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需包被)上室后加入血管平滑肌細(xì)胞懸浮液150 μL，培養(yǎng)24 h后依次以多聚甲醛、0.1%結(jié)晶紫染液固定20 min、染色10 min，于顯微鏡下觀察透過(guò)膜的血管平滑肌細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中DARS-AS1、miR-125a-5p表達(dá)水平 用1 mL Trizol裂解液提取血管平滑肌細(xì)胞中總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)在StepOne Plus Real-time PCR系統(tǒng)上按照熒光定量PCR試劑說(shuō)明書操作，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算DARS-AS1、miR-125a-5p表達(dá)。引物由上海生工公司制備。

1.3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)DARS-AS1與miR-125a-5p的靶向關(guān)系 構(gòu)建野生型載體WT-DARS-AS1與突變型載體MUT-DARS-AS1，分別將miR-NC、miR-125a-5p mimics與WT-DARS-AS1、MUT-DARS-AS1共轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，24 h后在雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)中測(cè)量血管平滑肌細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá) 血管平滑肌細(xì)胞在蛋白裂解液中裂解，等量蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，隨后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21一抗稀釋液(均為1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，條帶使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法可視化后用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 紅參抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖 與Control組比較，Hcy組細(xì)胞增殖率和CyclinD1蛋白水平升高，p21蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組細(xì)胞增殖率和CyclinD1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 Western Blot法檢測(cè)CyclinD1、p21蛋白表達(dá)條帶圖

表1 紅參抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖 (±s)

2.2 紅參抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 與Control組比較，Hcy組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表2 紅參抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞遷移及侵襲 (±s)

圖2 紅參抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞遷移及侵襲圖

圖3 各組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)條帶圖

2.3 紅參調(diào)控DARS-AS1、miR-125a-5p的表達(dá) 與Control組比較，Hcy組DARS-AS1的表達(dá)水平升高，miR-125a-5p的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組DARS-AS1的表達(dá)水平降低，miR-125a-5p的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 紅參調(diào)控DARS-AS1、miR-125a-5p的表達(dá) (±s)

2.4 干擾DARS-AS1表達(dá)抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲 Hcy+si-DARS-AS1組細(xì)胞增殖率及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平，遷移細(xì)胞數(shù)，侵襲細(xì)胞數(shù)比Hcy+si-NC組減少，p21蛋白表達(dá)水平比Hcy+si-NC組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖4。

表4 干擾DARS-AS1表達(dá)抑制Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲及CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá)比較 (±s)

圖4 干擾DARS-AS1表達(dá)后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá)條帶圖

2.5 DARS-AS1靶向調(diào)控miR-125a-5p DARS-AS1與miR-125a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，詳見(jiàn)圖5。miR-125a-5p過(guò)表達(dá)能夠降低WT-DARS-AS1的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表5。DARS-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-125a-5p的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

圖5 DARS-AS1與miR-125a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列示意圖

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s)

表6 DARS-AS1靶向調(diào)控miR-125a-5p的表達(dá) (±s)

2.6 DARS-AS1過(guò)表達(dá)可減弱紅參對(duì)Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用 Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1組細(xì)胞增殖率和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平，遷移細(xì)胞數(shù)與襲細(xì)胞數(shù)高于Hcy+RG-H+pcDNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p21蛋白、miR-125a-5p水平低于Hcy+RG-H+pcDNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6、表7。

圖6 DARS-AS1靶向調(diào)控后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá)條帶圖

表7 DARS-AS1過(guò)表達(dá)可減弱紅參對(duì)Hcy誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及調(diào)控CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá) (±s)

3 討 論

紅參在血管系統(tǒng)疾病等多種疾病中均具有一定治療作用，可通過(guò)促進(jìn)一氧化氮(NO)的合成及釋放從而發(fā)揮舒張血管的作用[9]。紅參提取物中紅參皂苷還可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[10]。本研究結(jié)果顯示，Hcy處理后血管平滑肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，并可促進(jìn)CyclinD1表達(dá)及抑制p21表達(dá)，而不同濃度的紅參處理后血管平滑肌細(xì)胞增殖能力降低，并可抑制CyclinD1表達(dá)及促進(jìn)p21表達(dá)。研究表明，下調(diào)CyclinD1表達(dá)及上調(diào)p21表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[11]，提示紅參可抑制Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性。血管平滑肌細(xì)胞遷移及侵襲與MMP-2、MMP-9表達(dá)密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，Hcy處理后可促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9表達(dá)，而不同濃度的紅參可抑制細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中DARS-AS1的表達(dá)水平明顯升高，而不同濃度的紅參處理后DARS-AS1的表達(dá)水平明顯降低，提示紅參可能通過(guò)調(diào)控DARS-AS1的表達(dá)從而影響血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。研究指出，DARS-AS1在卵巢癌中表達(dá)水平升高，并可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-532-3p從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示，干擾DARS-AS1的表達(dá)使Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力減弱，提示DARS-AS1可促進(jìn)Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究證實(shí)DARS-AS1可靶向結(jié)合miR-125a-5p。Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)水平降低，而不同濃度的紅參處理后miR-125a-5p的表達(dá)水平升高，提示紅參可能通過(guò)上調(diào)miR-125a-5p的表達(dá)從而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生過(guò)程。研究表明，干擾LnRNA MEG3 表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-125a-5p 的表達(dá)從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[14]。miR-125a-5p通過(guò)靶向ETS-1調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換[15]，提示紅參可能通過(guò)下調(diào)DARS-AS1的表達(dá)靶向調(diào)控miR-125a-5p來(lái)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。

綜上所述，紅參可抑制Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其作用機(jī)制與下調(diào)DARS-AS1的表達(dá)及上調(diào)miR-125a-5p的表達(dá)有關(guān)，DARS-AS1過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)紅參對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，進(jìn)一步證實(shí)紅參是通過(guò)抑制DARS-AS1而促進(jìn)miR-125a-5p的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，DARS-AS1可能為動(dòng)脈粥樣硬化治療的潛在靶點(diǎn)，本研究為進(jìn)一步闡釋紅參治療動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病的作用機(jī)制奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。