蘇 丞，孫雙喜，孟苗苗，徐祿玉，萬 燦，黃 燕

腦積水是世界范圍內(nèi)最常見的神經(jīng)外科疾病，腦積水是由于腦脊液的產(chǎn)生和吸收失衡或其通路受阻所致，導(dǎo)致腦脊液充滿的腦室擴張和顱內(nèi)壓升高。腦積水通常需手術(shù)治療，但術(shù)后并發(fā)癥較多，復(fù)發(fā)率較高。目前，內(nèi)科藥物治療、中西醫(yī)治療尚無特效藥物，多采用對癥干預(yù)，其中，甘露醇是最常見的脫水藥，但長時間使用副作用大。研究表明，炎癥反應(yīng)與腦積水的發(fā)病機制有關(guān)[1]。

五苓散是治療水液代謝異常的基本方，出自《傷寒雜病論》，由茯苓、澤瀉、豬苓、白術(shù)、桂枝組成，有健脾利水、溫陽化氣的功效，小便不利、水腫、口渴、體液停留、嘔吐、腹瀉、頭暈、頭重等主證表現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病腦積水有相同之處。多項研究表明，五苓散對于腦積水及正常顱壓腦積水有較好的療效，同時可減少并發(fā)癥[2-7]。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多通路的特點，且具有整體性和系統(tǒng)性，在干預(yù)具有多細胞、多因子共同參與調(diào)控的復(fù)雜病理生理過程中具有獨特的優(yōu)勢[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用計算機技術(shù)，系統(tǒng)全面地觀察藥物和疾病之間潛在的關(guān)系并進行可視化分析，有助于揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、發(fā)現(xiàn)藥物靶標、傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論[9]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)地闡述五苓散治療腦積水的作用機制，以期為臨床及基礎(chǔ)研究提供新思路[10-11]。

1 資料與方法

1.1 成分靶點信息查詢 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索五苓散中5種中藥豬苓、澤瀉、桂枝、茯苓和白術(shù)的成分，成分的篩選條件設(shè)置為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。將所獲得的成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swisstargets數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)獲得成分靶點。

1.2 疾病靶點查找 以“Hydrocephalus”為關(guān)鍵詞，在基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)和 美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行人類基因檢索。

1.3 關(guān)鍵靶點篩選及蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用R3.6.3軟件將五苓散化學(xué)成分作用靶點和腦積水相關(guān)的疾病靶點進行映射構(gòu)建韋恩圖。存在交集的共同靶點可能是五苓散中活性成分治療腦積水的關(guān)鍵靶點。將藥物疾病共有靶點輸入STING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均為默認設(shè)置，獲得 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點通路注釋分析 對篩選出的共同靶基因進行基因本體(GO)功能注釋和京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，對所預(yù)測的化學(xué)成分靶點進行富集分析，采用R 3.6.3 軟件進行可視化處理，分析五苓散治療腦積水可能的生物過程和信號通路。

1.5 化學(xué)成分-交集基因-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)上述化學(xué)成分的靶點預(yù)測結(jié)果，采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物組-化學(xué)成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡(luò)模型。在網(wǎng)絡(luò)中，用不同的形狀表示化學(xué)成分、交集基因、映射通路等信息，連接線表示兩節(jié)點間存在關(guān)聯(lián)或映射關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 五苓散成分靶點信息 共篩選出五苓散中5味中藥50種類藥成分，其中，豬苓11個，白術(shù)7個，茯苓15個，桂枝7個，澤瀉10個。收集類藥成分的靶點信息，其中，豬苓181個，白術(shù)124個，茯苓186個，桂枝226個，澤瀉183個，去重后共獲得五苓散類藥成分的作用靶點335個。

2.2 腦積水疾病靶點的篩選及共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到3 519個相關(guān)基因，OMIM-NCBI基因數(shù)據(jù)庫獲得70個相關(guān)基因，將這兩個數(shù)據(jù)庫的基因合并去重之后，獲得3 520個腦積水相關(guān)基因。采用R軟件制作3 520個疾病靶點與335個類藥成分作用靶點的韋恩圖，獲得疾病-類藥活性成分共同靶點105個(見圖1)。在STRING數(shù)據(jù)平臺輸入105個疾病與藥物共同靶點，分析后獲得PPI作用網(wǎng)絡(luò)，共獲得105個相互作用節(jié)點和1 147條相互作用關(guān)系(見圖2)。

圖1 疾病與藥物靶點韋恩圖

圖2 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 關(guān)鍵靶點GO生物功能注釋 應(yīng)用R軟件中clusterProfiler包對五苓散成分-疾病的105個共同作用靶蛋白進行GO生物功能注釋，保留P≤0.01的結(jié)果，進行可視化分析，獲得GO分析柱狀圖(見圖3)。結(jié)果可見，共同作用靶點主要富集在類固醇代謝過程(steroid metabolic process)、小分子代謝過程的調(diào)節(jié)(regulation of small molecule metabolic process)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育(reproductive structure development)等。

圖3 共同靶點GO分析柱狀圖

2.4 KEGG通路富集分析 應(yīng)用R軟件中clusterProfiler包對五苓散成分-疾病的105個共同作用靶蛋白進行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的結(jié)果，進行可視化分析，獲得KEGG通路富集氣泡圖(見圖4)?？梢姡餐悬c主要富集于癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、結(jié)核(tuberculosis)、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)。

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

2.5 構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建出五苓散中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)拓撲圖(見圖5)。使用network analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以度值(Degree)為評判標準可獲得較為重要的成分、靶點、通路。詳見表1。

圖5 中藥-成分-共同靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

表1 關(guān)鍵成分信息表

3 討 論

腦積水是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但其發(fā)生原因復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，當腦組織損傷時，炎性細胞的炎性反應(yīng)誘發(fā)室管膜瘢痕、腦室內(nèi)阻塞，這些物質(zhì)通過多種機制引起更多的細胞損傷和調(diào)亡，而許多抗炎藥物的相關(guān)研究也表明其對改善腦積水的有效性[12-14]。目前認為，腦積水的形成多為室管膜纖毛的功能障礙、水通道蛋白介導(dǎo)的高效跨膜和跨細胞水轉(zhuǎn)運腦脊液的循環(huán)障礙，還有出血后血紅蛋白降解物質(zhì)堵塞腦脊液通路這3個主要原因[15-18]。

五苓散可以治療的疾病的臨床表現(xiàn)主要是水液代謝障礙，表現(xiàn)為頭痛發(fā)熱、口渴、水入即吐、吐涎沫而頭目眩暈、短氣而咳、小便不利、水氣上逆等；腦積水的典型癥狀為頭痛、嘔吐、視力模糊、視神經(jīng)乳頭水腫、偶伴復(fù)視、眩暈及癲癇發(fā)作、血壓升高、呼吸紊亂、腦型鈉潴留及腦性耗鹽綜合征等，兩者在臨床表現(xiàn)上有很大的相同性。研究表明，桂枝具有抗病毒、抗菌、降糖、解熱、抗炎、抗敏、抗凝血、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、擴血管、神經(jīng)保護等作用[19-21]。白術(shù)的作用集中在胃腸道系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)，具有抗腫瘤、修復(fù)胃黏膜、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)整水液代謝、保肝、改善記憶力、調(diào)節(jié)脂代謝、降血糖、抗血小板、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[22-24]。而茯苓具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[25-27]。澤瀉具有利尿、抗結(jié)石及腎臟保護、降血脂及保肝、降血糖、抗癌、抗氧化損傷、抗炎、抗補體等多種藥理活性[28-29]。豬苓的藥理作用包括利尿、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抑菌、促進頭發(fā)生長等[30-32]。

本研究中，通過中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后，紫杉林(taxifolin)、兒茶素[(+)-catechin]、表兒茶素(ent-Epicatechin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)為篩選后的主要活性成分，這些成分均來自桂枝。相關(guān)研究表明，桂枝提取物通過下調(diào)Toll樣受體4/髓樣細胞分化因子88(TLR4/MyD88)信號通路有效抑制小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[33-34]。紫杉林具有抗氧化和抗炎作用[35]。兒茶素治療對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有神經(jīng)保護作用，這些作用可能是通過干預(yù)血腦屏障破壞和過度炎癥反應(yīng)的自我維持過程來實現(xiàn)的[36]。表兒茶素顯著刺激脾細胞增殖，可顯著增強自然殺傷(NK)細胞的細胞毒作用和巨噬細胞的吞噬功能，具有免疫調(diào)節(jié)活性[37]。β-谷甾醇通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路的激活而影響小膠質(zhì)細胞的活性從而減輕炎癥反應(yīng)[38]。此外，β-谷甾醇具有抑制血小板Aβ生成的潛在作用，可以改善粉樣前體蛋白/早老素1(APP/PS1)小鼠的記憶和學(xué)習(xí)障礙[39]。故五苓散可能通過上述核心成分的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)來治療腦積水。

在中藥-成分-靶點-信號通路的后續(xù)分析中，篩選出來的靶點有蛋白激酶 B信號1(AKT1)、白細胞介素6(IL6)、胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、重組人血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路在T細胞的發(fā)育和存活過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身反應(yīng)性免疫細胞有關(guān)[40]。AKT1對血管內(nèi)皮細胞功能和壁細胞覆蓋的調(diào)節(jié)在血管生成過程中對血管成熟有重要作用[41]，AKT1可調(diào)節(jié)血管張力和缺血誘導(dǎo)的動脈形成[42]。

通過KEGG通路分析可知，五苓散主要通過蛋白聚糖通路來治療腦積水。蛋白多糖是細胞外基質(zhì)的主要成分，是一組高度異質(zhì)的蛋白質(zhì)，其特征是糖胺多糖類型的特定線性碳水化合物鏈的共價連接，在細胞表面，這些分子調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子、生長因子、黏附分子的表達和活性，并作為信號輔助受體發(fā)揮作用[43]。蛋白多糖在神經(jīng)組織發(fā)育中的作用因其高度調(diào)控的時空表達模式而受到越來越多的關(guān)注，其可促進/抑制軸突生長，參與各種前體細胞類型的指定和成熟，調(diào)節(jié)細胞的遷移、軸突尋路、突觸發(fā)生和可塑性等行為[44-45]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞外信號向細胞內(nèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)換的重要橋梁[46]。抑制p38MAPK信號通路可有效改善缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和運動功能，減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，從而促進神經(jīng)元的恢復(fù)[47]。此外，MAPK信號通路對血腦屏障的破壞有預(yù)防作用[48]。同時MAPK是缺血性和出血性腦血管疾病的重要調(diào)節(jié)因子[49]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法與技術(shù)，挖掘到五苓散中50種類藥性成分及335個潛在靶點，腦積水疾病相關(guān)靶點3 520個，其中五苓散-腦積水共同靶點105個，通過對這些靶點進行GO生物過程及KEGG信號通路的富集分析，初步預(yù)測出五苓散可能是通過調(diào)節(jié)AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、VEGFA等靶點，調(diào)控癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號通路、乙型肝炎、結(jié)核、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的信號通路對腦積水進行有效治療。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過計算機輔助技術(shù)研究數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)系得來，得出的結(jié)果可作為后續(xù)研究的線索，為后續(xù)的臨床及實驗研究提供思路。