崔忠澤，何 雙，溫菲菲，李揚揚，許曉陽，路麗禎，吳淑華

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256600

結(jié)直腸癌是中國發(fā)病率第3 位的惡性腫瘤［1］。目前，對結(jié)直腸癌患者的臨床一線化療方法主要仍為以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化療方法［2］，且由于部分患者在臨床治療中存在著耐藥性和不良反應(yīng)，導(dǎo)致治療效果較差，進而影響患者的預(yù)后。

5-FU耐藥機制十分復(fù)雜，5-FU代謝酶異常是引起5-FU耐藥的重要機制之一［3-4］。其中5-FU代謝的限速酶二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD），在此過程中起到了重要的作用［5］。大量實驗及本課題組的前期研究都表明，在部分結(jié)直腸癌中DPD呈高表達，且與患者的耐藥及預(yù)后有關(guān)［3，6］。因此，深入研究DPD的表達及其作用機制，探索逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌5-FU耐藥的新途徑，對于進一步提高5-FU的臨床抗腫瘤效果、改善結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后具有重要的意義。

自噬是多步驟的細胞內(nèi)蛋白降解途徑［7］，在保持細胞代謝、穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。本文研究了自噬在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌DPD表達和5-FU耐藥中的作用及機制。應(yīng)用5-FU敏感和耐藥的人結(jié)腸癌細胞系，檢測DPD及自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵因子輕鏈3（light chain 3，LC3）［8］、P62［9-11］的表達，并通過調(diào)控自噬水平，觀察其對5-FU療效的影響，評估其在腫瘤細胞中對5-FU耐藥作用的影響。同時利用生物信息學(xué)分析預(yù)測并驗證參與自噬溶酶體途徑的E3連接酶NEDD4［12］與P62及DPD的關(guān)系，探討自噬降解DPD的分子機制，為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌5-FU耐藥提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸腺癌細胞系HCT-8、COLO205、LOVO和SW480及耐藥細胞株HCT-8/5-FU均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，β-actin、P62、LC3、DPD抗體購自英國Abcam公司，吉姆薩染液購自北京索萊寶科技有限公司，細胞內(nèi)自噬染色測定試劑盒［單丹磺酰尸胺（dansylcadaverine，MDC）法］、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，細胞增殖及細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，自噬干預(yù)藥物購自美國Glpbio公司（雷帕霉素、3-MA、HCQ），蛋白A/G磁珠和正常IgG購自中國武漢戴安生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞系接種于含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在耐藥細胞株中，添加5-FU使其最終含量達到5 μmol/L，以維持其對5-FU的耐藥性。視細胞生長情況傳代及換液。

1.2.2 Western blot檢測

采用Western blot檢測細胞系中LC3、P62和DPD蛋白含量。將細胞裂解充分后取上清液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測其蛋白濃度。取10 μL的試樣進行凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)印膜上。一抗4 ℃過夜。經(jīng)羊抗兔IgG二抗室溫下溫育1 h后，用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）法顯影。利用Image J軟件解析目標(biāo)圖像。目的基因蛋白相對表達量 = 目的基因灰度值/β-actin灰度值×100%。

1.2.3 MDC法染色

MDC能夠標(biāo)記自噬體，可反映自噬活性，使用MDC染色檢測細胞系中自噬體的形成。制備細胞懸液，以2×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。分別向各孔加入2 mL不同藥物或培養(yǎng)基干預(yù)24 h。向每孔中加入1 mL MDC染色工作液，溫育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)點狀熒光分布視為自噬激活，高倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)自噬激活細胞數(shù)所占百分比，取其平均值。

1.2.4 CCK-8實驗

應(yīng)用CCK-8實驗對細胞系進行5-FU藥物毒性測試。制備細胞懸液，設(shè)置實驗組與對照組，以1×103個/孔接種于96孔板中，每組設(shè)計4個復(fù)孔。于實驗組與對照組中分別注入200 μL含不同濃度5-FU的培養(yǎng)基和不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄置液體后注入10 μL CCK-8染液，37 ℃下溫育1 h后于酶標(biāo)儀450 nm處測量吸光度（D）值，計算細胞存活率/抑制率。

1.2.5 細胞侵襲試驗（transwell實驗）

Transwell小室模型置于24孔板中，制備濃度為5×105/mL的細胞懸液。并于小室上層加入細胞懸液100 μL，下室加入600 μL含20%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）培養(yǎng)基，每組細胞重復(fù)2個小室，培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕擦除上室側(cè)細胞及基質(zhì)膠，用甲醇溶液和吉姆薩染液分別進行固定和染色，顯微鏡下觀察穿透細胞數(shù)。每個腔室隨機取3個視野，計算平均 值。

抗戰(zhàn)爆發(fā)后，時代的影響，使得朱自清的散文風(fēng)格由抒情轉(zhuǎn)向說理，這時他寫的大多是有感于現(xiàn)實生活的論說類文章。他經(jīng)常對社會時局發(fā)表議論，并在激情吶喊中，宣傳正義力量及愛國思想。當(dāng)聞一多被暗殺后，面對動蕩的形勢，朱自清不顧個人安危，毅然前往參加他的追悼會并發(fā)表演講，還寫了文章《中國學(xué)術(shù)的大損失——悼聞一多先生》，沉痛哀悼了聞一多先生，并對聞一多的出眾才華以及在文學(xué)方面的卓越成就給予了高度評價，批判了國民黨的殘暴和反動的本質(zhì)。

1.2.6 平板克隆實驗

選擇呈指數(shù)生長的細胞制成細胞懸液，每組細胞分別以每孔約100個、200個、500個細胞接種于6孔板內(nèi)，并加入2 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)約1個星期，至產(chǎn)生肉眼可見的克隆球時結(jié)束。用甲醇溶液和吉姆薩染液分別進行固定和染色，肉眼下計算克隆數(shù)。

1.2.7 自噬抑制劑/激活劑干預(yù)細胞自噬實驗

選取用于自噬抑制劑/激活劑干預(yù)的實驗細胞，并分為4 組：雷帕霉素干預(yù)組、羥氯喹干預(yù)組、3-MA干預(yù)組和對照組。根據(jù)預(yù)實驗，設(shè)誘導(dǎo)自噬改變的最低藥物濃度為干預(yù)劑濃度，在各組細胞系中分別加入自噬激活劑雷帕霉素（0.10 μmol/L）、自噬抑阻斷劑羥氯喹（10.00 μmol/ L）、自噬抑制劑3-MA（100.00 μmol/ L）以及完全培養(yǎng)基各200 μL，培養(yǎng)24 h。應(yīng)用MDC染色檢測自噬狀態(tài)；采用Western blot檢測各組細胞株P(guān)62、DPD、LC3蛋白的表達；采用CCK-8實驗檢測不同干預(yù)劑對細胞增殖活性的影響。確定干預(yù)成功后，用于后續(xù)實驗。

1.2.8 聯(lián)合用藥干預(yù)HCT-8/5-FU細胞株生物學(xué)活性實驗

選取聯(lián)合用藥干預(yù)實驗細胞株，將其分為5組：生理鹽水對照組、5-FU實驗對照組以及5-FU聯(lián)合雷帕霉素、3-MA、羥氯喹的實驗干預(yù)組。分別在6孔板中加入2 mL自噬干預(yù)劑（藥物濃度同1.2.7）及等量生理鹽水預(yù)處理6 h，之后吸出培養(yǎng)液，取2 mL自噬干預(yù)劑及5-FU［5-FU濃度為半數(shù)抑制濃度（IC50）= 140.30 μmol/L］混合液加入實驗組中，5-FU對照組中加等量生理鹽水，培養(yǎng)24 h后，進行生物學(xué)活性實驗。

1.2.9 生物信息學(xué)預(yù)測E3連接酶

利用UbiBrowser在線網(wǎng)站（http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/）預(yù)測DPD蛋白的E3泛素連接酶。并選取最有可能的E3連接酶進行體外實驗分析。

1.2.10 NEDD4、DPD和P62免疫共沉淀實驗（co-inmunoprecipitationn, Co-IP）

為了確定E3連接酶在細胞中能否與DPD和（或）P62相互作用，我們進行了Co-IP實驗。用IP裂解液裂解細胞，將5 mg蛋白裂解液與50 μL蛋白A磁珠包被抗E3連接酶抗體混合，設(shè)置為IP組，將5 mg蛋白裂解液與同種屬IgG混合，設(shè)置為Input組，溫育16 h。采用Western blot檢測兩組中E3連接酶、DPD和P62的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，并運用Graphpad 7.0等應(yīng)用軟件完成制圖和信息的處 理。

2 結(jié) 果

2.1 不同細胞系中自噬與LC3、P62及DPD的表達情況及細胞耐藥性

為了評估自噬在不同細胞系中對5-FU的耐藥性，本研究檢測了一組人類結(jié)腸癌細胞系中LC3、P62及DPD的表達及對5-FU的敏感性。Western blot檢測結(jié)果結(jié)果顯示，DPD的表達在COLO205細胞最高，而在HCT-8細胞中最低（P＜0.05，圖2A）。CCK-8實驗結(jié)果顯示，COLO205細胞的IC50為269.20 μmol/L，LOVO細胞為187.40 μmol/ L，SW480細胞為97.53 μmol/L，HCT-8細胞為25.42 μmol/L（P＜0.05，圖2B），耐藥細胞株HCT-8/5-FU的IC50明顯高于親本細胞系（145 μmol/Lvs25.42 μmol/L；P＜0.05，圖2 B）。此外，與HCT-8細胞相比，HCT-8/5-FU細胞中DPD和P62表達水平顯著升高，而LC3-Ⅱ/LC3-I表達比例顯著降低（P＜0.05，圖2C）。上述結(jié)果表明，與HCT-8細胞相比，HCT-8/5-FU細胞的基礎(chǔ)自噬活性可能較低。此外，本研究采用MDC法檢測自噬水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HCT-8細胞相比，HCT-8/5-FU細胞含有明顯較少的光點樣結(jié)構(gòu)（P＜0.05，圖2D～2F），這支持了5-FU耐藥細胞自噬活性水平較低的假設(shè)。

圖1 結(jié)直腸癌細胞自噬、DPD及耐藥水平Fig.1 Levels of autophagy, DPD and drug resistance in colon cancer cells

2.2 自噬抑制劑與誘導(dǎo)劑干預(yù)后HCT-8/5-FU細胞株中LC3、P62及DPD的表達情況

選擇HCT-8和HCT-8/5-FU細胞株進行藥物干預(yù)實驗。對HCT-8/5-FU細胞株進行藥物干預(yù)，應(yīng)用MDC染色法觀察自噬的發(fā)生，Western blot檢測干預(yù)前后細胞內(nèi)LC3、P62及DPD蛋白含量。雷帕霉素干預(yù)組中，自噬激活細胞數(shù)量較對照組明顯增加，DPD的表達則明顯下降，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2、3）；3-MA干預(yù)組中，自噬激活細胞數(shù)量較對照組減少，而DPD表達明顯增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值下降（P＜0.05，圖2、3）；羥氯喹組干預(yù)組中，自噬激活細胞數(shù)量較對照組明顯增多，DPD及P62的表達同步增加，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升（P＜0.05，圖2、3）。以同樣方法干預(yù)HCT-8細胞株，運用MDC法檢測自噬的發(fā)生（圖2F ～ 2J），采用Western blot檢測DPD表達量（圖3F ～ 3G），其結(jié)果與HCT-8/5-FU細胞株一致。

圖2 MDC染色檢測不同干預(yù)組中自噬水平Fig.2 MDC staining to detect autophagy levels in different intervention groups

2.3 不同自噬干預(yù)劑干預(yù)HCT-8和HCT-8/5-FU細胞株對5-FU的化學(xué)敏感性

CCK-8實驗檢測不同藥物干預(yù)后HCT-8和HCT-8/5-FU耐藥細胞株的生存率，結(jié)果顯示，較生理鹽水對照組相比，單獨應(yīng)用雷帕霉素（0.10 μmol/L）、3-MA（100.00 μmol/L）、羥氯喹（10.00 μmol/L）干預(yù)，細胞增殖活性雖有所降低，但腫瘤細胞依然表現(xiàn)出較強的藥物抵抗（表1）。而聯(lián)合應(yīng)用5-FU （HCT-8為25.42 μmol/L；HCT-8/5-FU為145.00 μmol/L）后，對腫瘤產(chǎn)生了不同程度的抑制，其抑制效果因自噬干預(yù)劑的不同而不同。雷帕霉素 + 5-FU聯(lián)合應(yīng)用組較其他3組比較，對5-FU的化學(xué)敏感性顯著增強（P＜0.05，表1）。

2.4 自噬抑制劑與激活劑聯(lián)合5-FU對耐藥細胞株的克隆能力及侵襲能力的影響

平板克隆實驗結(jié)果顯示，雷帕霉素 + 5-FU組與其他3組比較，細胞克隆球數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A ～ E，圖5A ～ E）。Transwell實驗結(jié)果顯示，雷帕霉素 + 5-FU組與其他3組比較，穿膜細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4F ～ 4J，圖5F ～ 5J）。

表1 CCK-8實驗檢測不同藥物干預(yù)后HCT-8和HCT-8/5-FU細胞株的存活率Tab.1 CCK-8 assay was used to detect the survival rate of HCT-8 and HCT-8/5-FU cell lines after different drug intervention(±s)

表1 CCK-8實驗檢測不同藥物干預(yù)后HCT-8和HCT-8/5-FU細胞株的存活率Tab.1 CCK-8 assay was used to detect the survival rate of HCT-8 and HCT-8/5-FU cell lines after different drug intervention(±s)

*: P＜0.05, compared with each other.

VariableControlRapamycin3-MAHCQ HCT-8 Autophagy intervention100±1.9193.41±0.7292.33±1.1191.21±1.28 Combined application of 5-FU and autophagy intervention50.00±0.9522.92±2.36*45.67±1.9844.42±3.04 HCT-8/5-FU Autophagy intervention100±1.3693.25±1.3292.67±0.9091.57±0.95 Combined application of 5-FU and autophagy intervention50.00±1.0426.26±1.93*46.56±2.2645.72±2.05

2.5 E3連接酶的篩選及Co-IP檢測NEDD4與DPD/P62相互作用

在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser中的篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEDD4是DPD最有價值的E3連接酶，并選取其作為DPD的E3連接酶進行后續(xù)實驗。

為證明在結(jié)腸腺癌HCT-8/5-FU細胞株中，NEDD4能夠與DPD以及P62結(jié)合。采用Co-IP實驗使用NEDD4抗體溫育，經(jīng)NEDD4抗體沉淀下來的蛋白分別用NEDD4抗體和DPD/P62抗體檢測（圖6）。IP組能檢測到NEDD4目的誘餌蛋白；而IgG不能檢測到這種蛋白，說明抗體富集成功；同時IP組能檢測到DPD或p62蛋白而IgG組檢測不到，說明DPD或P62可以與NEDD4結(jié)合。

圖4 平板克隆實驗（接種細胞密度500個/孔）及Tran swell實驗檢測HCT-8細胞株在受到不同干預(yù)后的增殖能力及侵襲能力Fig.4 Plate cloning assay (500 cells/hole) and transwell assay were used to detect the proliferation and invasion ability of HCT-8 cell lines after different interventions

圖5 平板克隆實驗（接種細胞密度200個/孔）及transwell實驗檢測HCT-8/5-FU細胞株在受到不同干預(yù)后的增殖能力及侵襲能力Fig.5 Plate cloning assay (200 cells/hole) and transwell assay were used to detect the proliferation and invasion ability of HCT-8/5-FU cell lines after different interventions

圖6 Co-IP檢測NEDD4與DPD/P62相互作用Fig.6 E3 Co-IP detection of NEDD4 interaction with DPD/P62

3 討 論

自噬溶酶體途徑通常被認(rèn)為是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)主要的降解途徑之一，主要負(fù)責(zé)去除可溶性蛋白質(zhì)、細胞器、生物大分子復(fù)合體及異物等［7］。研究［13］證明，自噬-溶酶體途徑與多種疾病有關(guān)。Bonam等［14］研究表明，自噬-溶酶體通路能夠作為帕金森病的潛在治療靶點，Yang等［15］發(fā)現(xiàn)，溶酶體功能障礙和自噬阻斷通過AMPK/mTOR途徑參與自噬相關(guān)抑癌肽誘導(dǎo)的宮頸癌細胞毒性死亡。研究［16］發(fā)現(xiàn)，自噬與腫瘤耐藥密切相關(guān)，但其對腫瘤耐藥的作用仍存在爭議。一方面，自噬可以增強癌細胞對化療藥物的耐受，Xuan等［17］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中抑制伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提高藥物敏感性。而另一方面，自噬在一定條件下又可增強化療藥物的效果，Yang等［18］發(fā)現(xiàn)，自噬激活可促進5-FU在HCT-116細胞中的抗癌作用。因此，自噬在結(jié)直腸癌中對5-FU化療作用的影響及其機制還有待進一步研究。

研究證實，DPD異常表達與腫瘤患者對5-FU的化療耐受密切相關(guān)［5］。DPD是5-FU代謝過程中的限速酶，體內(nèi)80%以上的5-FU均是被DPD所代謝，只有極少部分的5-FU產(chǎn)生了抗腫瘤作用［19］，DPD的高表達可加速5-FU的分解代謝，從而減少藥物濃度，進而降低藥物的療效［20］。在結(jié)直腸癌的體外實驗研究中，DPD的異常高表達可降低5-FU的化療敏感性［21-22］。本實驗結(jié)果表明，DPD高表達的細胞系往往伴隨對5-FU更高的耐受。因此，通過調(diào)控DPD的表達，降低5-FU的分解代謝，可能成為提高5-FU療效的有效途徑。盡管自噬與5-FU耐藥是腫瘤耐藥研究的熱點，但目前關(guān)于細胞自噬與5-FU代謝限速酶DPD之間的相關(guān)研究較少，而關(guān)于自噬溶酶體途徑與DPD降解的關(guān)系及干預(yù)自噬溶酶體途徑影響DPD的含量，從而逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對5-FU耐藥的相關(guān)研究鮮見報道。課題組前期研究［6］表明，結(jié)直腸癌中自噬與DPD的表達密切相關(guān)，并且DPD高表達影響患者化療效果及預(yù)后，但其機制尚缺乏深入研究。為了評估自噬與5-FU耐藥的關(guān)系，選取DPD表達最低的HCT-8細胞，并購買其耐藥株HCT-8/5-FU細胞株，檢測其自噬與DPD表達水平及細胞的耐藥性。結(jié)果顯示，HCT-8/5-FU耐藥細胞株與HCT-8親本細胞系相比自噬活性減弱，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低，而DPD表達顯著增高。應(yīng)用5-FU處理后細胞表現(xiàn)對5-FU耐受，細胞增殖活性依然保持較高水平。提示HCT-8/5-FU的耐藥性與細胞的低水平自噬及DPD高表達有關(guān)。因此，深入研究自噬影響DPD與結(jié)直腸癌耐藥的關(guān)系具有重要價值。為此，本實驗就自噬發(fā)生、發(fā)展過程及不同水平自噬與DPD對5-FU耐藥的關(guān)系進行了進一步研究。

眾所周知，自噬溶酶體途徑過程包括吞噬泡形成、自噬體產(chǎn)生、自噬溶酶體產(chǎn)生和分解，在細胞自噬體的生成過程中LC3-I會向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)移［8］，而在細胞自噬溶酶體途徑中重要的環(huán)節(jié)是細胞自噬體和溶酶體的結(jié)合，才可完成蛋白質(zhì)降解，完成細胞內(nèi)經(jīng)自噬溶酶體途徑蛋白質(zhì)代謝的全程。毋庸置疑，該過程的調(diào)控機制復(fù)雜，涉及多個步驟和眾多因子。其中P62作為影響自噬體和溶酶體的結(jié)合的關(guān)鍵因子在該過程中的作用受到廣泛關(guān)注。研究［9-10］顯示，P62是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的多功能蛋白，有多種結(jié)構(gòu)域，其中與細胞自噬溶酶體途徑密切相關(guān)的主要是LC3相互作用區(qū)和C端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域，P62通過在LC3相互作用區(qū)參與自噬溶酶體形成，并利用UBA結(jié)構(gòu)域?qū)⒍喾核鼗牡孜飩鬟f給自噬體，從而實現(xiàn)了降解蛋白質(zhì)的過程［6］。與此同時，作為載體蛋白的P62也會與底物同時被降解，故在細胞自噬激活時往往也會伴隨著P62蛋白質(zhì)水平的下降［11］，因此，P62在自噬與腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。研究［23］表明，LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降和P62水平增加，是自噬活性被抑制的重要標(biāo)志，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平升高同時伴隨P62水平的降低，則提示自噬流的產(chǎn)生。本課題組前期對201例結(jié)直腸癌臨床樣本組織中P62、LC-3和DPD表達的相關(guān)性及其臨床意義進行了研究［6］，結(jié)果提示，LC3和P62可影響DPD的表達，自噬-溶酶體途徑可能是DPD降解的重要途徑。為進一步研究其機制，本實驗通過檢測HCT-8/5-FU耐藥細胞和HCT-8親本細胞中自噬活性及LC3和P62、DPD的表達，發(fā)現(xiàn)HCT-8/5-FU細胞中LC3的陽性率明顯低于HCT-8細胞，而P62及DPD的表達則明顯高于HCT-8細胞。我們推測，結(jié)直腸癌對5-FU的耐藥可能是自噬溶酶體途徑抑制、DPD積累而導(dǎo)致的。為證實噬活性與P62、DPD的關(guān)系，我們又通過構(gòu)建自噬抑制/激活的細胞模型，采用MDC染色和Western blot檢測開展了進一步的驗證。其中，自噬激活劑雷帕霉素通過抑制mTOR通路進而激活自噬的發(fā)生［24］，自噬抑制劑3-MA作為PI3K抑制劑可以干擾或阻斷自噬體的形成［25］，而HCQ抑制自噬體與溶酶體的融合過程［26］，在此過程中LC3-I會不斷向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)移而不會被消耗，進而使LC3Ⅱ異常積累，同時因自噬不能完成，P62的含量也會增加。

本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用3-MA可導(dǎo)致自噬活性抑制，DPD表達量的升高。而雷帕霉素則可導(dǎo)致自噬激活，DPD表達下降，提示自噬的發(fā)生能夠降低DPD的含量。本實驗進一步應(yīng)用羥氯喹阻斷自噬流的發(fā)生，使自噬體與溶酶體不能融合成為自噬溶酶體，結(jié)果導(dǎo)致LC3、P62、DPD同時升高。提示自噬溶酶體途徑參與了DPD的降解，而且這一過程需要完整的自噬流參與，即單一的自噬體形成并不能影響DPD的含量，只有形成自噬溶酶體才能降解DPD。因此，進一步研究通過改變自噬活性，影響DPD的表達，進而逆轉(zhuǎn)腫瘤對5-FU的耐藥性。

有研究［27］表明，抑制自噬可增強多種抗腫瘤藥物的療效，然而Yang等［18］發(fā)現(xiàn)自噬促進化療藥物的抗癌作用，自噬誘導(dǎo)劑與5-FU聯(lián)合應(yīng)用將有利于HCT116癌細胞的化療。我們推測這是由于5-FU特殊的藥物代謝動力學(xué)所導(dǎo)致的，即自噬能夠影響5-FU代謝關(guān)鍵酶DPD的表達水平，進而影響5-FU的有效藥物濃度，但調(diào)控這一過程是否能逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細胞對5-FU的耐藥性尚不清楚。我們對HCT-8/5-FU細胞株進行自噬干預(yù)劑與5-FU聯(lián)合用藥的實驗。結(jié)果顯示，應(yīng)用自噬激活劑可導(dǎo)致對細胞抑制率顯著升高，其效果遠大于自噬激活劑本身對細胞的殺傷作用，并且其增殖活性和侵襲能力均顯著下降，而5-FU聯(lián)合自噬抑制劑或阻斷劑用藥后的作用效果明顯降低。我們推測，這可能是由于自噬溶酶體途徑的激活，進而降解了細胞內(nèi)的DPD，當(dāng)DPD含量下降時，會導(dǎo)致5-FU降解減少，進而藥物有效濃度上升，對細胞殺傷作用增強，從而起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用；而當(dāng)應(yīng)用自噬抑制劑時，自噬溶酶體途徑受抑制，DPD不被降解而積累，進一步促進5-FU的分解代謝，導(dǎo)致腫瘤細胞對5-FU的耐受。另有研究［28-29］表明，3-MA和HCQ通過自噬以外的機制促進5-FU對腫瘤細胞的毒性作用，雖然5-FU聯(lián)合3-MA或HCQ降低了DPD的降解，但對細胞的殺傷作用相對強于對照組。因此，我們認(rèn)為雖然自噬抑制劑可以通過降低DPD的降解在一定程度上保護腫瘤細胞免受5-FU的殺傷作用，但還有其他因素導(dǎo)致自噬抑制劑促進5-FU對腫瘤細胞的殺傷作用。在降解DPD逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥、促進對5-FU敏感性的協(xié)同作用方面還有待進一步探討。本實驗結(jié)果提示，自噬的激活可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對5-FU的耐藥性，提高5-FU的治療效果。

本實驗結(jié)果顯示，DPD可以由自噬途徑降解，但DPD的降解的過程及其機制尚未見報道。大量研究［30-31］表明，蛋白質(zhì)的降解信號是泛素化，而E3連接酶是蛋白泛素化標(biāo)記過程中標(biāo)記目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵酶［32］，本實驗通過在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser，預(yù)測并篩選了最有可能成為DPD泛素化過程中的E3連接酶—NEDD4，并通過Co-IP實驗證實，在結(jié)腸癌HCT-8/5-FU細胞株中NEDD4能夠與DPD及P62結(jié)合。NEDD4通過一個保守的LIR結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用，并受到LC3的調(diào)控從而調(diào)節(jié)自噬調(diào)節(jié)蛋白［12］。而P62通過與LC3相互作用區(qū)參與自噬溶酶體形成，并將多泛素化的底物傳遞給自噬體［9-10］。本實驗證實，NEDD4作為E3鏈接酶與DPD結(jié)合，對其進行泛素化標(biāo)記，并與P62連接形成蛋白復(fù)合物，共同參與DPD的自噬溶酶體降解。而在P62與LC3結(jié)合將泛素化底物DPD送往自噬體過程中，LC3又作為NEDD4激活劑促進這一過程。因此，我們認(rèn)為，NEDD4是鏈接DPD與P62、LC3的橋梁，在自噬溶酶體降解DPD的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，自噬與腫瘤細胞耐藥有關(guān)，在結(jié)直腸癌細胞中激活自噬可通過降解DPD進而逆轉(zhuǎn)耐藥細胞對5-FU的耐藥性。本研究從細胞生物學(xué)角度對LC3與P62組成的自噬-溶酶體途徑與DPD的表達及腫瘤耐藥進行了探討，其分子機制可能是通過NEDD4介導(dǎo)的DPD泛素化并通過P62轉(zhuǎn)移到自噬溶酶體降解這一過程實現(xiàn)的。對于某些與自噬代謝途徑有關(guān)的藥物，尋找其調(diào)控自噬代謝的有效途徑，對提高其療效具有重要的指導(dǎo)意義。另外，自噬降解DPD的過程中，是否有其他途徑參與以及其修飾位點和結(jié)合位點尚需進一步探究。總之，自噬參與DPD降解影響結(jié)直腸癌細胞對化療藥物的敏感性，激活自噬可促進DPD降解和抑制5-FU分解代謝，可能成為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌5-FU耐藥的新途徑。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。